[發(fā)明專利]一種通過加強胞內(nèi)代謝提高甾醇轉(zhuǎn)化的方法

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• 申請日: 2020-06-30
• 公開（公告）號: CN111621539A
• 公開（公告）日: 2020-09-04
• 發(fā)明（設計）人: 王敏;張揚;申雁冰;周秀玲;駱健美;夏夢雷;張曉
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12P33/02
• 分類號: C12P33/02;C12P33/06;C12P33/18;C12P17/06;C12R1/33;C12R1/32
• 代理公司: 北京瑞盛銘杰知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙) 11617
• 代理人: 栗華楠

本發(fā)明屬于生物催化技術領域，具體涉及一種加強胞內(nèi)代謝提高甾醇轉(zhuǎn)化能力高效生產(chǎn)甾藥前體的方法。本發(fā)明是通過向甾藥前體生產(chǎn)菌株發(fā)酵培養(yǎng)基中添加甘蔗糖蜜和廢菌體水解液，來提高甾藥前體生產(chǎn)菌株胞內(nèi)NAD⁺和輔酶A的水平，增強代謝丙酰輔酶A的甲基丙二酰途徑中各關鍵酶的轉(zhuǎn)錄水平，從而提高菌株代謝丙酰輔酶A的能力，高效發(fā)酵生產(chǎn)甾藥前體。

技術領域：

本發(fā)明屬于生物催化技術領域，具體涉及一種加強胞內(nèi)代謝提高甾醇轉(zhuǎn)化能力高效生產(chǎn)甾藥前體的方法。

背景技術：

甾體藥物簡稱甾藥,現(xiàn)已在臨床上廣泛應用,作為僅次于抗生素的第二大類藥物是制藥工業(yè)中重要的生產(chǎn)產(chǎn)品。目前制藥企業(yè)主要采用微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化的方法以植物甾醇為原料生產(chǎn)甾藥的多種核心前體，如4-雄甾烯-3,17-二酮(AD)、1,4-雄甾烯-3,17-二酮(ADD)、9α-羥基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9α-OH-AD)等。通過這些核心前體可以合成絕大部分的甾藥。目前，用于甾藥前體生產(chǎn)的主要是快速生長的土壤分枝桿菌、簡單節(jié)桿菌以及紅球菌等微生物。作為化學合成的替代，生物轉(zhuǎn)化已成為制藥工業(yè)中生產(chǎn)甾藥前體的主要生產(chǎn)方法。但無論是原始菌株還是工程菌株均具有較長的轉(zhuǎn)化周期(≥120小時)，且在轉(zhuǎn)化中后期菌株的轉(zhuǎn)化效率的急劇降低并伴隨產(chǎn)物降解，這也是造成甾藥前體生產(chǎn)成本高昂的原因之一。

以甾醇為底物生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)甾藥核心前體時，甾醇在微生物的作用下會發(fā)生側(cè)鏈的降解。在該過程中需要NAD⁺和輔酶A等輔因子，以產(chǎn)生大量的NADH、乙酰輔酶A和丙酰輔酶A。NAD⁺和輔酶A的胞內(nèi)水平的提高有助于甾醇側(cè)鏈的降解。甾醇側(cè)鏈降解產(chǎn)生的丙酰輔酶A可經(jīng)甲基丙二酰途徑進入三羧酸循環(huán)。在該途徑中丙酰輔酶A被生物素依賴的丙酰輔酶A羧化酶(PCC)催化丙酰輔酶A羧合成(S)-甲基丙二酰輔酶A，隨后甲基丙二酰輔酶A差向異構酶(MCEE)又將其消旋化為(R)-型對映體，(R)-甲基丙二酰輔酶A最后被甲基丙二酰輔酶A變位酶異構化為琥珀酰輔酶A進入三羧酸循環(huán)，氰鈷胺(維生素B12)則是甲基丙二酰輔酶A變位酶的輔酶。當有丙酰輔酶A大量產(chǎn)生超出甲基丙二酰途徑代謝能力或甲基丙二酰途徑中的各酶發(fā)生變異導致該代謝途徑代謝能力減弱或阻斷時就會發(fā)生丙酰輔酶A的過量積累。大量的丙酰輔酶A會對細胞產(chǎn)生毒害作用，甚至會致死。甾藥前體生產(chǎn)菌株的生產(chǎn)能力越強所產(chǎn)生的丙酰輔酶A就會越多，丙酰輔酶A的積累是影響菌體活力，降低轉(zhuǎn)化效率，延長轉(zhuǎn)化周期的主要原因之一。

目前，提高甾藥前體生產(chǎn)菌株生產(chǎn)能力的方法多是針對甾醇代謝途徑中關鍵酶的改造，這些方法往往只關注單酶或少數(shù)幾個酶的功能加強，忽視了對代謝通路全局的把握。這些方法的缺陷是引發(fā)甾醇代謝過程中輔因子的供應不足和有毒中間產(chǎn)物的積累。因此需要一種能夠提高胞內(nèi)輔因子水平、減少中間代謝產(chǎn)物積累的方法以提高甾藥前體生產(chǎn)菌株的甾醇轉(zhuǎn)化能力。

發(fā)明內(nèi)容：

針對上述問題，本發(fā)明將利用甘蔗糖蜜和廢菌體水解液提高胞內(nèi)輔酶I(NADH和NAD⁺)的水平，加強甾醇側(cè)鏈的降解，加強丙酰輔酶A的甲基丙二酰代謝途徑，減輕因丙酰輔酶A過程積累對菌株造成的毒害作用，以解決微生物法甾藥前體生產(chǎn)時存在的發(fā)酵周期長、生產(chǎn)效率低的問題，為甾藥前體生產(chǎn)成本的降低提供新方法。

本發(fā)明實現(xiàn)上述目的的技術方案，是通過向甾藥前體生產(chǎn)菌株發(fā)酵培養(yǎng)基中添加甘蔗糖蜜和廢菌體水解液，來提高甾藥前體生產(chǎn)菌株胞內(nèi)胞內(nèi)輔酶I的水平，增強代謝丙酰輔酶A的甲基丙二酰途徑中各關鍵酶的轉(zhuǎn)錄水平，從而提高菌株代謝丙酰輔酶A的能力，高效發(fā)酵生產(chǎn)甾藥前體；

所述的甾藥前體，包括但并不限于雄甾-4-烯-3,17-二酮(androst-4-ene-3,17-dione，AD)、9α-羥基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9α-hydroxyandrost-4-ene-3,17-dione，9α-OH-AD)、雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(Androst-1,4-diene-3,17-dione，ADD)、A環(huán)降解物等；