[發明專利]一株豬繁殖與呼吸綜合征病毒1型分離株感染性克隆構建、拯救與應用

在審

• 申請號: 202010611744.2
• 申請日: 2020-06-30
• 公開（公告）號: CN111676247A
• 公開（公告）日: 2020-09-18
• 發明（設計）人: 陳南華;李樹濱;朱建中
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/40;C12N7/00;A61K39/12;A61P31/14;C12R1/93
• 代理公司: 揚州蘇中專利事務所(普通合伙) 32222
• 代理人: 沈志海

一株豬繁殖與呼吸綜合征病毒1型分離株感染性克隆構建、拯救與應用，本發明提供一株豬繁殖與呼吸綜合征病毒1型（PRRSV1）野毒株的感染性克隆病毒，為研究PRRSV1的Marc?145細胞適應性決定因素提供關鍵遺傳操作平臺。同時，針對目前我國缺乏PRRSV1疫苗的實際問題，本發明的PRRSV1野毒株感染性克隆平臺，還可用于研制更加安全高效的新型PRRSV1基因工程疫苗。

技術領域

本發明涉及生物工程技術領域，具體涉及一株豬繁殖與呼吸綜合征病毒1型 毒株感染性克隆構建、拯救、改造及其應用。

背景技術

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndromevirus, PRRSV)在全世界養豬國家中廣泛流行。PRRSV感染主要引起母豬流產以及整 個豬群的呼吸道癥狀。PRRSV可分為兩個基因型(PRRSV1和PRRSV2)和多個 基因亞型。1995年，我國首次出現PRRSV2并迅速在全國傳播。2006年，我國 暴發高致病性PRRSV2變異株(HP-PRRSV)引起的“豬高熱病”。此外，近幾年 PRRSV1野毒株也陸續在我國香港、內蒙古、黑龍江、遼寧、福建、貴州等省市 分離。

PRRSV是一種單股正鏈RNA病毒，屬于套式病毒目動脈炎病毒科。PRRSV 基因組大小約為15kb，5’端有帽子結構，3’端有Poly(A)尾，中間有10個開放 閱讀框(ORF)。ORF1a和ORF1b編碼至少16個非結構蛋白，在病毒復制和轉 錄中發揮重要作用。ORF2-7編碼8個結構蛋白用以構成感染性病毒粒子。

我國同時存在PRRSV1和PRRSV2分離株，而且PRRSV1和PRRSV2毒株 又可分為多個亞型。基于某一基因亞型毒株研制的商品化疫苗可有效防控同源型 PRRSV野毒株感染引發的繁殖障礙與呼吸道癥狀，但其交叉保護性差。盡管近 幾年PRRSV1不斷在中國豬群分離，但現有中國PRRS疫苗均為2型PRRS疫苗。 因此，急需研制對抗我國PRRSV1感染的新型特異性疫苗。然而，由于我國現有PRRSV1分離株只能在原代肺泡巨噬細胞PAM，無法在傳代Marc-145細胞上培 養。成為研制PRRSV1傳代活疫苗的一大難題。

RNA病毒感染性克隆是通過體外構建病毒cDNA克隆，在DNA水平上對病 毒基因進行人工操作，再通過體外拯救出感染性病毒粒子。PRRSV1感染性克隆 的成功構建與遺傳操作可用于新型基因工程疫苗研制。盡管前人研究中已經建立 了PRRSV反向遺傳操作平臺，然而，基于我國PRRSV1野毒株的反向遺傳操作 平臺至今未有報道。

發明內容

針對我國PRRSV1野毒株難以在傳代Marc-145細胞上體外培養的科學問題， 本發明提供一株豬繁殖與呼吸綜合征病毒1型(PRRSV1)野毒株的感染性克隆 病毒，為研究PRRSV1的Marc-145細胞適應性決定因素提供關鍵遺傳操作平臺。 同時，針對目前我國缺乏PRRSV1疫苗的實際問題，本發明的PRRSV1野毒株 感染性克隆平臺，還可用于研制更加安全高效的新型PRRSV1基因工程疫苗。

本發明是通過以下技術方案實現的：

在本發明的一個方面，提供了一種重組載體，包含PRRSV1基因組全長cDNA 序列，該全長cDNA序列的5’端加有巨細胞病毒(Cytomegalovirus,CMV)真核 啟動子序列，3’端Poly(A)尾下游加有丁肝炎病毒核酶(Hepatitis D virus ribozyme) 序列以及牛生長激素多聚腺苷酸信號(Bovine Growth Hormone(BGH) polyadenylation signal)轉錄終止序列。

本發明優選的載體為pACYC177低拷貝載體。經過基因合成和同源重組等方 法在pACYC177載體上插入五個單一限制性酶切位點(SgsI,Pfl23II,BglII， Bsp1407I和XbaI)用于PRRSV1弱毒株HLJB1的感染性克隆構建。