[發(fā)明專利]用于檢測AMY2B基因拷貝數(shù)的PCR擴增引物和探針及其應(yīng)用

在審

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• 申請日: 2020-06-28
• 公開（公告）號: CN111826435A
• 公開（公告）日: 2020-10-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 詹芳潔;蘭小鵬;徐冬閩
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇〇醫(yī)院
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 北京中濟緯天專利代理有限公司 11429
• 代理人: 張磊

本發(fā)明涉及一種用于檢測AMY2B基因拷貝數(shù)的PCR擴增引物和探針及其應(yīng)用，所述PCR擴增引物包括上游引物以及下游引物，所述上游引物與下游引物的序列分別為：上游引物：5’?GAACCATGATCACACCACTGCATTCT?3’，下游引物：5’?TGTGCTACACTCCCAACACCTTAAATCA?3’；所述探針的序列為5’?CTGGGTGACAGAGTGAGACCCTCTCCCTCC?3’，本發(fā)明設(shè)計的PCR擴增引物具有良好的特異性，其能對AMY2B基因特異性擴增，而對全血DNA樣本中的其他基因不擴增，該PCR擴增引物與探針結(jié)合可快速檢測AMY2B基因拷貝數(shù)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)臨床分子檢測領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測AMY2B 基因拷貝數(shù)的PCR擴增引物和探針及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

淀粉酶(AMY)全稱是1，4-α-D-葡聚糖水解酶，是最重要的水解碳水化合物的酶，催化淀粉及糖原水解，生成葡萄糖、麥芽糖及含有α1，6-糖苷鍵支鏈的糊精。血液淀粉酶主要由胰腺和唾液腺分泌，因此淀粉酶的同工酶主要分為兩型：唾液型S-AMY及胰腺型P-AMY。人類1號常染色體上的淀粉酶基因簇形成主要包含：唾液型(AMY1A/1B/1C)、胰腺型(AMY2B/2B)及AMYP。在不同的人種、種族中存在廣泛拷貝數(shù)變異(CNV)，且個體間差異較大，如AMY1拷貝數(shù)范圍從1-27，AMY2B從0-8,AMY2B從2-6。以淀粉類飲食為主的人種，淀粉酶水平高于低淀粉飲食人種，且其淀粉酶基因的拷貝數(shù)(CN)朝向增加的方向發(fā)展。

代謝綜合征(metabolic syndrome，MS)病因尚未明確，目前認為是多基因和多種環(huán)境相互作用的結(jié)果，與遺傳、免疫等均有密切關(guān)系。MS是一組以肥胖、高血糖(糖尿病或糖調(diào)節(jié)受損)、血脂異常(高甘油三酯血癥和/或低高密度脂蛋白膽固醇血癥)以及高血壓等聚集發(fā)病并嚴重影響機體健康的臨床癥候群，是在代謝上相互關(guān)聯(lián)的危險因素組合，被醫(yī)學(xué)界稱為“死亡四重奏”，嚴重影響人們的健康與生活質(zhì)量。有研究指出低血清淀粉酶水平與肥胖、高血壓、血脂和糖代謝紊亂有關(guān)，AMY1 CNV與肥胖間存在關(guān)聯(lián)，并且認為AMY1基因可作為受基因-飲食共同影響的疾病及與碳水化合物代謝有關(guān)的疾病生物標志。我們認為AMYCNV與MS發(fā)病之間存在密切聯(lián)系，這對臨床工作中發(fā)現(xiàn)MS發(fā)病的高危人群，并對其進行早期預(yù)防和臨床診療提供重要依據(jù)。現(xiàn)有的研究均集中于唾液型AMY1，但血清淀粉酶除唾液淀粉酶還包含胰淀粉酶，對于胰腺型基因 AMY2B/2B CNV與MS的具體相關(guān)性有待我們進一步探究。

由此可見，快速而準確地檢測淀粉酶基因拷貝數(shù)對臨床個體化診療及醫(yī)學(xué)研究具有重要意義。目前國內(nèi)市場上常用的上述基因檢測方法主要有 GreenⅠ，Taqman熒光定量PCR法及微滴數(shù)字PCR法(ddPCR)等，熒光定量 PCR的基本原理是在反應(yīng)體系中加入熒光分子，通過熒光信號的按比例增加來反應(yīng)DNA量的增加，從而對PCR產(chǎn)物進行實時檢測。是一種結(jié)合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長的染料，其與DNA的結(jié)合是非特異性的，此方法雖然操作簡便、快速，但缺乏特異性，準確性差。Taqman熒光定量PCR法及ddPCR等技術(shù)克服了以上不足，操作簡便、快速，特異性高，并可實現(xiàn)高通量檢測。一般來講，常用的定量PCR法通過設(shè)計一對或多對目的基因特異性引物及相應(yīng)探針，進行PCR擴增。但考慮到淀粉酶各個基因之間的同源性非常高，AMY1基因序列與AMY2B的同源性為93.2％，與AMY2B的同源性為93.6％，AMY2B和AMY2B基因的同源性為94％，結(jié)果易出現(xiàn)假陽性，從而影響其準確性。因此，本領(lǐng)域急需一種能夠用于檢測AMY2B基因拷貝數(shù)的特異性引物和探針以及操作簡便、快速且準確度高的定量方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種能夠?qū)MY2B基因進行特異性擴增且用于快速檢測AMY2B基因拷貝數(shù)的PCR擴增引物和探針及其應(yīng)用。

本發(fā)明的目的通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)：一種用于檢測AMY2B基因拷貝數(shù)的PCR擴增引物和探針，所述PCR擴增引物包括上游引物以及下游引物，所述上游引物與下游引物的序列分別為：