[發明專利]用于檢測AMY2B基因拷貝數的PCR擴增引物和探針及其應用

在審

• 申請號: 202010601616.X
• 申請日: 2020-06-28
• 公開（公告）號: CN111826435A
• 公開（公告）日: 2020-10-27
• 發明（設計）人: 詹芳潔;蘭小鵬;徐冬閩
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍聯勤保障部隊第九〇〇醫院
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 北京中濟緯天專利代理有限公司 11429
• 代理人: 張磊

1.一種用于檢測AMY2B基因拷貝數的PCR擴增引物和探針，其特征在于：所述PCR擴增引物包括上游引物以及下游引物，所述上游引物與下游引物的序列分別為：

上游引物：5’-GAACCATGATCACACCACTGCATTCT-3’，

下游引物：5’-TGTGCTACACTCCCAACACCTTAAATCA-3’；

所述探針的序列為5’-CTGGGTGACAGAGTGAGACCCTCTCCCTCC-3’，且其5’端的報告基團為FAM或HEX，3’端的淬滅基團為BHQ-1。

2.一種利用權利要求1所述的PCR擴增引物和探針檢測AMY2B基因拷貝數的方法，其特征在于：利用所述PCR擴增引物和探針，以待測血樣中提取的DNA樣本為模板，建立實時熒光定量PCR檢測方法，得出待測血樣DNA樣本的AMY2B基因的拷貝數。

3.根據權利要求2所述的檢測AMY2B基因拷貝數的方法，其特征在于：它包括以下步驟：

(1)實時熒光定量PCR標準曲線的建立：

a.全血中提取DNA樣本；

b.構建標準品：利用所述PCR擴增引物和探針，以步驟a所得的DNA樣本為模板，建立反應體系，進行PCR擴增，將PCR擴增的目的片段進行膠回收測序，確定為目的片段后連接到克隆T載體上，然后進行涂平板、挑菌、培養、提質粒測序，驗證片段已經插入后，測定其濃度，計算拷貝數，作為實時熒光定量PCR方法的標準品；

c.繪制標準曲線：將標準品倍比稀釋，并計算出不同濃度標準品對應的起始拷貝數，以不同濃度的標準品為DNA模板，利用所述PCR擴增引物和探針進行實時熒光定量PCR反應，獲得對應的擴增動力學曲線；以不同濃度標準品對應的起始拷貝數的對數為橫坐標，以循環數閾值為縱坐標，繪制出標準曲線并得到對應的標準曲線方程；

(2)檢測：

Ⅰ.提取待測血樣中的DNA樣本；

Ⅱ.PCR擴增：利用PCR擴增引物和探針，以步驟Ⅰ提取的DNA樣本為模板，建立反應體系，進行實時熒光定量PCR反應，隨著循環次數的增加，被擴增的目的基因片段呈指數規律增長，通過實時檢測與之對應的隨擴增而變化熒光信號強度，求得Ct值，將所得的Ct值代入標準曲線方程中，計算得到待測血樣中DNA樣本的AMY2B基因的拷貝數。