[發(fā)明專利]一種肝細胞體外共培養(yǎng)體系及其構(gòu)建方法與應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010601331.6
• 申請日: 2020-06-28
• 公開（公告）號: CN111808795A
• 公開（公告）日: 2020-10-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 高博韜
• 申請（專利權(quán)）人: 廣東省醫(yī)療器械研究所
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12Q1/02
• 代理公司: 廣州嘉權(quán)專利商標事務(wù)所有限公司 44205
• 代理人: 胡輝

本發(fā)明公開了一種肝細胞體外共培養(yǎng)體系及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。一種肝細胞體外共培養(yǎng)體系，包括細胞外基質(zhì)、肝細胞以及3T3?J2成纖維細胞；所述的肝細胞種于所述的細胞外基質(zhì)上，所述的肝細胞表面鋪有所述的3T3?J2成纖維細胞。所述的肝細胞體外共培養(yǎng)體系的構(gòu)建方法如下：將3T3?J2成纖維細胞接種在溫度敏感性培養(yǎng)皿上，培養(yǎng)，剝離，得到。本發(fā)明提供的肝細胞體外共培養(yǎng)體系為人類肝細胞提供了一個更接近于體內(nèi)肝組織微環(huán)境的立體形態(tài)，保證了緊密的肝細胞/肝細胞相互連接及肝細胞/支持細胞的相互作用，可以有效增強并維持肝細胞功能，進而可以用于長期藥物評估。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于細胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種肝細胞體外共培養(yǎng)體系及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)

藥物性肝損傷是導(dǎo)致藥物研發(fā)失敗以及藥物上市后被撤回的重要原因。由于動物與人的種屬差異性，動物模型并不能保證準確預(yù)測藥物在人體內(nèi)的肝毒性。因此，建立穩(wěn)定可靠的體外人類原代肝細胞模型并用于預(yù)測藥物的肝毒性尤為重要。然而，人類原代肝細胞在普通二維體外培養(yǎng)過程中，由于缺乏體內(nèi)肝臟的三維結(jié)構(gòu)、細胞間相互作用以及生長因子的支持，會快速失去正常的形態(tài)和功能，從而導(dǎo)致肝細胞的藥物代謝功能降低，進而影響其用于藥物肝毒性篩選評估。因此，長期維持肝細胞的藥物代謝功能是建立人類肝細胞模型所需要考慮的重要問題。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服現(xiàn)有肝細胞在二維體外培養(yǎng)過程中存在快速失去正常的形態(tài)和功能從而導(dǎo)致肝細胞的藥物代謝功能降低的問題，本發(fā)明第一個方面的目的，在于提供一種肝細胞體外共培養(yǎng)體系。

本發(fā)明第二個方面的目的，在于提供上述肝細胞體外共培養(yǎng)體系的構(gòu)建方法。

本發(fā)明第三個方面的目的，在于提供一種包括上述肝細胞體外共培養(yǎng)體系的試劑盒。

本發(fā)明第四個方面的目的，在于提供上述肝細胞體外共培養(yǎng)體系的應(yīng)用。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

本發(fā)明的第一個方面，提供一種肝細胞體外共培養(yǎng)體系，包括細胞外基質(zhì)、肝細胞以及3T3-J2成纖維細胞；所述的肝細胞種于所述的細胞外基質(zhì)上，所述的肝細胞表面鋪有所述的3T3-J2成纖維細胞。

所述的細胞外基質(zhì)包括膠原、基質(zhì)膠在內(nèi)的所有天然類及合成類的細胞外基質(zhì)；優(yōu)選為膠原蛋白；更優(yōu)選為鼠尾腱Ⅰ型膠原蛋白。

所述的肝細胞優(yōu)選為永生化細胞系、原代細胞、衍生自多能干細胞中的至少一種；更優(yōu)選為原代細胞。

所述的肝細胞的來源優(yōu)選為人。

所述的3T3-J2成纖維細胞優(yōu)選為3T3-J2成纖維細胞薄片。

所述的3T3-J2成纖維細胞薄片優(yōu)選通過如下步驟得到：將3T3-J2成纖維細胞接種在溫度敏感性培養(yǎng)皿上，培養(yǎng)，剝離，得到3T3-J2成纖維細胞薄片。

所述的3T3-J2成纖維細胞的接種數(shù)優(yōu)選為120萬～240萬；更優(yōu)選為150萬～200萬。

所述的溫度敏感性培養(yǎng)皿優(yōu)選為預(yù)涂胎牛血清的溫度敏感性培養(yǎng)皿。

所述的預(yù)涂胎牛血清的溫度敏感性培養(yǎng)皿優(yōu)選通過如下方法得到：取胎牛血清加入溫度敏感性培養(yǎng)皿，36～38℃過夜涂層，得到。

所述的培養(yǎng)優(yōu)選依次包括第一次培養(yǎng)和第二次培養(yǎng)。

所述的第一次培養(yǎng)的條件優(yōu)選為35～39℃、3％～7％CO₂濃度下培養(yǎng)3～5天；更優(yōu)選為36～38℃、4％～6％CO₂濃度下培養(yǎng)3.5～4.5天；最優(yōu)選為37℃、5％CO₂濃度下培養(yǎng)4天。

所述的第二次培養(yǎng)的條件優(yōu)選為18～22℃下培養(yǎng)0.5～2.5h；更優(yōu)選為20℃下培養(yǎng)1h-2h。