[發(fā)明專利]用于早佳絲瓜雜交種子純度鑒定的SSR引物及方法

在審

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• 申請日: 2020-06-29
• 公開（公告）號: CN111961740A
• 公開（公告）日: 2020-11-20
• 發(fā)明（設計）人: 韓小霞;胡新軍;李勇奇;閔子揚;袁祖華
• 申請（專利權）人: 湖南省蔬菜研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 長沙和雅知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙) 43238
• 代理人: 林傳貴

本發(fā)明屬于分子檢測技術領域，具體涉及一種用于早佳絲瓜雜交種子純度鑒定的SSR引物及方法。本發(fā)明的方法可用于早佳絲瓜雜交種的純度檢測，可有效的將雜交種與父本和母本區(qū)分開來，快速檢測出雜交種的純度。本方法具有簡單、快速、準確、成本低、操作簡單等優(yōu)點，采用該方法一人一天可完成近500個樣品的檢測，可代替?zhèn)鹘y(tǒng)絲瓜雜交種的純度鑒定方法，操作簡便，節(jié)省人工，不需要占用土地，結果準確可靠，極大提高了鑒定效率，降低鑒定費用，具有較高的商業(yè)應用價值。

技術領域

本發(fā)明屬于分子檢測技術領域，具體涉及一種用于早佳絲瓜雜交種子純度鑒定的SSR引物及方法。

背景技術

絲瓜是葫蘆科(Cucurbitaceae)絲瓜屬中的栽培種，一年生攀緣性草本植物。我國栽培的絲瓜在植物學上有兩個種，即普通絲瓜(Luffa cylindrica(L.)M.J.Roem.)和有棱絲瓜(Luffa acutangula(L.)Roxb.)。早佳絲瓜屬于普通絲瓜(Luffa cylindrica(L.)M.J.Roem.)中的肉絲瓜。在絲瓜雜交種制種過程中，主要采用母本去雄的方式。即將父母本根據(jù)生育期分別播種，在母本雌花開花前，人工將其所有雄花花蕾摘掉。開花期將父本的花粉采集，并授粉到母本雌花的柱頭上，從而獲得雜交種。由于絲瓜雄花為無限花絮，人工去雄容易不徹底。如果母本去雄不徹底，母本的花粉可能會飄落到或者由昆蟲傳播到其自身的柱頭上，從而產(chǎn)生假雜交種，這是生產(chǎn)中導致種子純度下降的主要因素。根據(jù)中華人民共和國國家標準(GB8079-87)的相關規(guī)定，絲瓜雜交種純度必須達到90％才可以銷售。

傳統(tǒng)的絲瓜雜交種純度檢測主要采用形態(tài)學鑒定，主要根據(jù)母本和雜交種的種子、子房的形態(tài)鑒定，該方法實用性強，但鑒定時間需要60天左右，存在周期長、占地面積大、受環(huán)境影響大等缺陷。目前，采用分子標記鑒定雜交種純度具穩(wěn)定性好、信息量大等優(yōu)點，已被廣泛應用于作物種子純度質量檢測，如現(xiàn)有技術中已有絲瓜SSR標記用于有棱絲瓜“雅綠6號”和普通絲瓜“絲盛2號”雜交種純度鑒定的報道，但用于早佳絲瓜純度鑒定的引物和方法還未見報道。同時，目前絲瓜SSR分子標記鑒定雜交種純度仍存在著：(1)基因組提取采用CTAB法或者SOD法，操作步驟繁瑣、費時；(2)未經(jīng)過優(yōu)化的PCR反應體系和程序浪費成本；(3)銀染步驟染色和顯色環(huán)節(jié)操作繁瑣，結果不穩(wěn)定等技術問題。

發(fā)明內容

針對以上技術問題，本發(fā)明的目的是提供一種用于‘早佳絲瓜’雜交種子純度鑒定的SSR引物及方法，能夠快速準確地將雜交種與父本和母本區(qū)分開來，檢測出雜交種的純度。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案：

首先，本發(fā)明提供一種用于早佳絲瓜雜交種子純度鑒定的SSR引物，其包括上游引物SF32和下游引物SR32，所述上游引物SF32的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述下游引物SR32的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

其次，本發(fā)明提供一種早佳絲瓜雜交種子純度的鑒定方法，包括以下步驟：

(1)提取早佳絲瓜親本以及雜交種后代基因組DNA；

(2)以所述步驟(1)提取的基因組DNA為模板，使用權利要求1所述引物SF32和SR32進行PCR擴增，得到擴增產(chǎn)物；

(3)對步驟(2)所述擴增產(chǎn)物采用凝膠電泳檢測，顯色，統(tǒng)計電泳結果；

(4)對步驟(3)所述電泳結果進行分析，同時具有親本特異性條帶的單株為真正的雜交種，缺少其中任意一條帶則為假雜種。

進一步地，所述步驟(1)中基因組DNA的提取方法具體為：將待提取樣品放入PCR板中，并加入0.25mol/L的NaOH溶液50μl，沸水中煮3min，用鑷子取出PCR板，加入0.1mol/L pH＝8.0的Tris﹒HCl 150μl中和反應。

所述待提取樣品包括但不限于胚根、胚軸等，對雜交種子及發(fā)芽植株葉片和各部位均適應。