[發明專利]一種亮氨酸脫氫酶突變體及其應用

有效

• 申請號: 202010601081.6
• 申請日: 2020-06-28
• 公開（公告）號: CN111676203B
• 公開（公告）日: 2022-02-01
• 發明（設計）人: 饒志明;徐美娟;陳佳杰;張顯;楊套偉;邵明龍
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/06
• 分類號: C12N9/06;C12N15/53;C12N15/70;C12N1/21;C12P13/04;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 彭素琴

本發明公開了一種亮氨酸脫氫酶突變體及其應用，屬于酶工程和微生物工程技術領域。本發明提供了一種亮氨酸脫氫酶突變體，所述亮氨酸脫氫酶突變體與氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的亮氨酸脫氫酶相比，第72位氨基酸由賴氨酸突變為了丙氨酸，本發明首次對亮氨酸脫氫酶底物通道內堿性氨基酸殘基進行定點突變，改造了酶可能底物結合位點附近的結構及環境，獲得了更加高效制備L?2?氨基丁酸的亮氨酸脫氫酶。本發明提供的底物耐受性提高的亮氨酸脫氫酶突變體亮氨酸脫氫酶突變體K72A能耐受4.5g/L 2?酮丁酸且對于底物2?酮丁酸的催化活力提高了15％。

技術領域

本發明涉及一種亮氨酸脫氫酶突變體及其應用，屬于酶工程和微生物工程技術領域。

背景技術

L-2-氨基丁酸在食品、農業、生物醫藥等方面有著很大的應用價值，如它是用于治療抗癲癇藥物左已拉西坦、布瓦西坦的直接前體，也是用于合成治療結核病的藥物鹽酸乙胺丁醇的重要手性前體。亮氨酸脫氫酶(leucine dehydrogenase,LeuDH，EC 1.4.1.9)屬于氧化還原酶家族，已被廣泛用于非天然氨基酸的制備，如L-2-氨基丁酸(Tao,R.,Jiang,Y.,Zhu,F.et al.A one-pot system for production of L-2-aminobutyric acid from L-threonine by L-threonine deaminase and a NADH-regeneration system based on L-leucine dehydrogenase and formate dehydrogenase.Biotechnol Lett 36,835–841(2014))，L-叔亮氨酸(Li J,Pan J,Zhang J,et al.Stereoselective synthesis of L-tert-leucine by a newly cloned leucine dehydrogenase from Exiguobacteriumsibiricum[J].Journal of Molecular Catalysis B Enzymatic,2014,105(7):11-17)等。并且已有較多文獻對亮氨酸脫氫酶偶聯輔酶循環及蘇氨酸脫氨酶的一鍋法制備進行研究優化，但是，在其制備非天然氨基酸如L-2-氨基丁酸的過程中存在亮氨酸脫氫酶的底物不耐受性的缺點，因此，急需找到一種在L-2-氨基丁酸生產過程中對底物耐受性強的亮氨酸脫氫酶。

發明內容

為解決上述技術問題，本發明提供了一種亮氨酸脫氫酶突變體，所述亮氨酸脫氫酶突變體與氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的亮氨酸脫氫酶相比，第72位氨基酸由賴氨酸突變為了丙氨酸。

在本發明的一種實施方式中，編碼所述亮氨酸脫氫酶突變體的核苷酸序列如SEQID NO.3所示。

在本發明的一種實施方式中，所述亮氨酸脫氫酶來源于西伯利亞桿菌Exiguobacterium sibiricum。

本發明還提供了一種編碼上述亮氨酸脫氫酶突變體的基因。

本發明還提供了攜帶上述基因的重組質粒。

在本發明的一種實施方式中，所述載體為pET-28a質粒。

本發明還提供了攜帶上述基因或上述重組質粒的宿主細胞。

在本發明的一種實施方式中，所述宿主細胞為細菌或真菌。

在本發明的一種實施方式中，所述宿主細胞為E.coli BL21(DE3)、E.coli JM109、E.coli DH5α。

本發明還提供了產上述亮氨酸脫氫酶突變體的制備方法，所述方法為將上述基因工程菌的種子液接入到培養基中進行發酵，發酵結束后，收集菌液，離心收集菌體，重懸后破碎菌體，離心收集上清，從上清液中分離得到亮氨酸脫氫酶突變體。