[發明專利]用于檢測AMY2A基因拷貝數的PCR擴增引物和探針及其應用

在審

• 申請號: 202010600622.3
• 申請日: 2020-06-28
• 公開（公告）號: CN111662976A
• 公開（公告）日: 2020-09-15
• 發明（設計）人: 詹芳潔;蘭小鵬;徐冬閩
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍聯勤保障部隊第九〇〇醫院
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 北京中濟緯天專利代理有限公司 11429
• 代理人: 張磊

本發明涉及一種用于檢測AMY2A基因拷貝數的PCR擴增引物和探針及其應用，所述PCR擴增引物包括上游引物以及下游引物，所述上游引物與下游引物的序列分別為：上游引物：5’?GCTACTGGGTTTAGGCCAATCAGG?3’，下游引物：5’?GAGAGGAGACAAAGACCCTCTCC?3’；所述探針的序列為5’?TCAGGCCTGGCGCTGGGCTGCAT?3’；本發明的PCR擴增引物具有良好的特異性，其能對AMY2A基因特異性擴增，而對全血DNA樣本中的其他基因不擴增，該PCR擴增引物與探針結合可檢測AMY2A基因拷貝數。

技術領域

本發明屬于生物醫學臨床分子檢測領域，具體涉及一種用于檢測AMY2A基因拷貝數的PCR擴增引物和探針及其應用。

背景技術

淀粉酶(AMY)全稱是1，4-α-D-葡聚糖水解酶，是最重要的水解碳水化合物的酶，催化淀粉及糖原水解，生成葡萄糖、麥芽糖及含有α1，6-糖苷鍵支鏈的糊精。血液淀粉酶主要由胰腺和唾液腺分泌，因此淀粉酶的同工酶主要分為兩型：唾液型S-AMY及胰腺型P-AMY。人類1號常染色體上的淀粉酶基因簇形成主要包含：唾液型(AMY1A/1B/1C)、胰腺型(AMY2A/2B)及AMYP。在不同的人種、種族中存在廣泛拷貝數變異(CNV)，且個體間差異較大，如AMY1拷貝數范圍從1-27，AMY2A 0-8拷貝，AMY2B 2-6拷貝。以淀粉類飲食為主的人種，淀粉酶水平高于低淀粉飲食人種，且其淀粉酶基因的拷貝數(CN)朝向增加的方向發展。

代謝綜合征(metabolic syndrome，MS)病因尚未明確，目前認為是多基因和多種環境相互作用的結果，與遺傳、免疫等均有密切關系。MS是一組以肥胖、高血糖(糖尿病或糖調節受損)、血脂異常(高甘油三酯血癥和/或低高密度脂蛋白膽固醇血癥)以及高血壓等聚集發病并嚴重影響機體健康的臨床癥候群，是在代謝上相互關聯的危險因素組合，被醫學界稱為“死亡四重奏”，嚴重影響人們的健康與生活質量。有研究指出低血清淀粉酶水平與肥胖、高血壓、血脂和糖代謝紊亂有關，AMY1CNV與肥胖間存在關聯，并且認為AMY1基因可作為受基因-飲食共同影響的疾病及與碳水化合物代謝有關的疾病生物標志。我們認為AMYCNV與MS發病之間存在密切聯系，這對臨床工作中發現MS發病的高危人群，并對其進行早期預防和臨床診療提供重要依據。現有的研究均集中于唾液型AMY1，但血清淀粉酶除唾液淀粉酶還包含胰淀粉酶，對于胰腺型基因AMY2A/2B CNV與MS的具體相關性有待我們進一步探究。

由此可見，快速而準確地檢測淀粉酶基因拷貝數對臨床個體化診療及醫學研究具有重要意義。目前國內市場上常用的上述基因檢測方法主要有GreenI，Taqman熒光定量PCR法及微滴數字PCR法(ddPCR)等，熒光定量PCR的基本原理是在反應體系中加入熒光分子，通過熒光信號的按比例增加來反應DNA量的增加，從而對PCR產物進行實時檢測。GreenI是一種結合于所有dsDNA雙螺旋小溝區域的具有綠色激發波長的染料，其與DNA的結合是非特異性的，此方法雖然操作簡便、快速，但缺乏特異性，準確性差。Taqman熒光定量PCR法及ddPCR等技術克服了以上不足，操作簡便、快速，特異性高，并可實現高通量檢測。一般來講，常用的定量PCR法通過設計一對或多對目的基因特異性引物及相應探針，進行PCR擴增。但考慮到淀粉酶各個基因之間的同源性非常高，AMY1基因序列與AMY2A的同源性為93.2％，與AMY2B的同源性為93.6％，AMY2A和AMY2B基因的同源性為94％，結果易出現假陽性，從而影響其準確性。因此，本領域急需一種能夠用于檢測AMY2A基因拷貝數的特異性引物和探針以及操作簡便、快速且準確度高的定量方法。

發明內容

本發明的目的在于提供一種能夠對AMY2A基因進行特異性擴增且用于快速檢測AMY2A基因拷貝數的PCR擴增引物和探針及其應用。

本發明的目的通過如下技術方案實現：一種用于檢測AMY2A基因拷貝數的PCR擴增引物和探針，所述PCR擴增引物包括上游引物以及下游引物，所述上游引物與下游引物的序列分別為：

上游引物：