[發(fā)明專利]用于檢測AMY2A基因拷貝數(shù)的PCR擴(kuò)增引物和探針及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010600622.3
• 申請日: 2020-06-28
• 公開（公告）號: CN111662976A
• 公開（公告）日: 2020-09-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 詹芳潔;蘭小鵬;徐冬閩
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇〇醫(yī)院
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 北京中濟(jì)緯天專利代理有限公司 11429
• 代理人: 張磊

1.一種用于檢測AMY2A基因拷貝數(shù)的PCR擴(kuò)增引物和探針，其特征在于：所述PCR擴(kuò)增引物包括上游引物以及下游引物，所述上游引物與下游引物的序列分別為：

上游引物：5’-GCTACTGGGTTTAGGCCAATCAGG-3’，

下游引物：5’-GAGAGGAGACAAAGACCCTCTCC-3’；

所述探針的序列為5’-TCAGGCCTGGCGCTGGGCTGCAT-3’，且其5’端的報(bào)告基團(tuán)為FAM或HEX，3’端的淬滅基團(tuán)為BHQ-1。

2.一種利用權(quán)利要求1所述的PCR擴(kuò)增引物和探針檢測AMY2A基因拷貝數(shù)的方法，其特征在于：利用所述PCR擴(kuò)增引物和探針，以待測血樣中提取的DNA樣本為模板，建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法，得出待測血樣DNA樣本的AMY2A基因的拷貝數(shù)。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測AMY2A基因拷貝數(shù)的方法，其特征在于：它包括以下步驟：

(1)實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：

a.全血中提取DNA樣本；

b.構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品：利用所述PCR擴(kuò)增引物和探針，以步驟a所得的DNA樣本為模板，建立反應(yīng)體系，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR擴(kuò)增的目的片段進(jìn)行膠回收測序，確定為目的片段后連接到克隆T載體上，然后進(jìn)行涂平板、挑菌、培養(yǎng)、提質(zhì)粒測序，驗(yàn)證片段已經(jīng)插入后，測定其濃度，計(jì)算拷貝數(shù)，作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的標(biāo)準(zhǔn)品；

c.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：將標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋，并計(jì)算出不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)的起始拷貝數(shù)，以不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品為DNA模板，利用所述PCR擴(kuò)增引物和探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，獲得對應(yīng)的擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線；以不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)的起始拷貝數(shù)的對數(shù)為橫坐標(biāo)，以循環(huán)數(shù)閾值為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線并得到對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程；

(2)檢測：

Ⅰ.提取待測血樣中的DNA樣本；

Ⅱ.PCR擴(kuò)增：利用PCR擴(kuò)增引物和探針，以步驟Ⅰ提取的DNA樣本為模板，建立反應(yīng)體系，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，隨著循環(huán)次數(shù)的增加，被擴(kuò)增的目的基因片段呈指數(shù)規(guī)律增長，通過實(shí)時(shí)檢測與之對應(yīng)的隨擴(kuò)增而變化熒光信號強(qiáng)度，求得Ct值，將所得的Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中，計(jì)算得到待測血樣中DNA樣本的AMY2A基因的拷貝數(shù)。