[發(fā)明專利]一種乙型肝炎表面抗原檢測試劑盒

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• 申請日: 2020-06-28
• 公開（公告）號: CN111707827A
• 公開（公告）日: 2020-09-25
• 發(fā)明（設計）人: 張振斌;李華;史光輝;欒大偉;劉萍
• 申請（專利權）人: 博奧賽斯（天津）生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/576
• 分類號: G01N33/576;G01N33/543;G01N33/535
• 代理公司: 天津企興智財知識產權代理有限公司 12226
• 代理人: 王曉英

1.一種乙型肝炎表面抗原檢測試劑盒，其特征在于：包括堿性磷酸酶標記F(ab')₂HBsAg羊多抗，磁微粒-HBsAg抗體。

2.根據權利要求1所述的乙型肝炎表面抗原檢測試劑盒，其特征在于：堿性磷酸酶標記F(ab')₂HBsAg羊多抗的工作濃度為0.01～0.5μg/mL；磁微粒-HBsAg抗體的工作濃度為0.1-2mg/mL。

3.根據權利要求1或2所述的乙型肝炎表面抗原檢測試劑盒，其特征在于：堿性磷酸酶標記F(ab')₂HBsAg羊多抗的制備包括如下步驟，

1)待標記原料F(ab')₂HBsAg羊多抗裝入透析袋中，用0.02-0.05M的碳酸鹽緩沖液，透析30min；

2)將標記原料F(ab')₂HBsAg羊多抗與活化的堿性磷酸酶按質量比1:(1-4)進行混合，之后用0.02-0.05M碳酸鹽緩沖液于4℃透析16-24h，期間換液2-3次；

3)配制濃度為2-5mg/mL的NaBH₄水溶液，按1mgALP加80μL配制好的NaBH₄水溶液的比例進行混合，并于4℃避光反應2h；

4)將上述步驟3)完成的標記液用0.01M PBS于4℃透析24h，加入等體積甘油，-20℃保存。

4.根據權利要求3所述的乙型肝炎表面抗原檢測試劑盒，其特征在于：活化的堿性磷酸酶的制備，包括如下步驟，

1)配制2-15mg/mL ALP溶液；

2)配制10-20mg/mL過碘酸鈉NaIO₄溶液；

3)將上述1)和2)配制溶液按體積比1：1混勻，室溫避光反應30min；

4)配制濃度為20-50μL/mL的乙二醇水溶液，與上述溶液3)以相同體積混合，常溫避光反應30min，活化即完成，放-20℃保存。

5.根據權利要求3所述的乙型肝炎表面抗原檢測試劑盒，其特征在于：所述F(ab')₂HBsAg羊多抗的制備包括如下步驟，

1)取抗體HBsAg羊多抗溶液，逐滴加入等體積飽和硫酸銨并不斷攪拌，室溫靜置30min后12000rpm離心5min，棄上清；

2)按抗體量加入0.1-0.5M檸檬酸，pH2-5緩沖液溶解抗體，并使抗體終濃度為5-20mg/ml，最后透析至0.1-0.5M檸檬酸，pH2-5緩沖液；

3)用0.1-0.5M檸檬酸，pH2-5緩沖液溶解胃蛋白酶，終濃度為50-200mg/ml；

4)按抗體：胃蛋白酶質量比(5-20)：1的比例，向抗體溶液中加入胃蛋白酶，并充分混勻；

5)于37℃水浴反應30min，期間不斷混勻樣品，加入適量1-3M Tris，pH7-9，調節(jié)反應體系pH至中性終止反應；

6)將酶切后抗體溶液透析至10-30mM哌嗪，pH5-7緩沖液中；

7)在還原和非還原條件下，SDS-PAGE檢測抗體酶切程度，分析抗體是否酶切完全。

6.根據權利要求5所述的乙型肝炎表面抗原檢測試劑盒，其特征在于：所述F(ab')₂HBsAg羊多抗的制備還包括純化過程，所述純化過程包括以下步驟，

a)用10-30mM哌嗪，pH5-7緩沖液平衡好的CM sepharose陽離子柱；

b)將酶切完全的抗體產物透析至10-30mM哌嗪，pH5-7緩沖液中，過濾后上樣至用pH5-710-30mM哌嗪緩沖液平衡好的CM sepharose陽離子柱，棄穿透液；

c)用10-30mM哌嗪，pH5-7緩沖液繼續(xù)洗滌柱子，至UV值降至20mAU；

d)用含1-5M NaCl pH5-7，10-30mM哌嗪緩沖液洗脫，收集洗脫峰；

e)將洗脫液透析至PBS緩沖液中，即為F(ab’)₂抗體片段。