[發明專利]一種從赤潮異彎藻細胞中提取高質量DNA的方法

在審

• 申請號: 202010597957.4
• 申請日: 2020-06-28
• 公開（公告）號: CN111607636A
• 公開（公告）日: 2020-09-01
• 發明（設計）人: 胡廣偉;張珍珍;姬南京;申欣;蔡月鳳;覃昊;石一彪;鄧圣賢
• 申請（專利權）人: 江蘇海洋大學
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806
• 代理公司: 北京和聯順知識產權代理有限公司 11621
• 代理人: 閆超良

本發明公開了一種從赤潮異彎藻細胞中提取高質量DNA的方法，包括如下步驟：藻細胞的培養；藻細胞裂解緩沖液的篩選；藻細胞收集方法摸索；萃取、沉淀和洗滌以及DNA濃度、純度和完整性的分析，本方法主要通過使用過濾膜收集赤潮異彎藻細胞的方法和選擇合適的CTAB細胞裂解液，結果表明，使用新方法提取得到的赤潮異灣藻基因組DNA無論在質量上還是完整度上均優于其他方法，適用于PCR分析和DNA高通量測序。

技術領域

本發明涉及赤潮異彎藻DNA提取領域，具體為一種從赤潮異彎藻細胞中提取高質量DNA的方法。

背景技術

有害藻華是由于某些藻類爆發性增殖而形成的，可對海洋生態系統和當地經濟造成重大破壞。近年來，有害藻華的發生頻率、強度和地理分布在世界各地都有所增加。赤潮異彎藻是典型的赤潮物種，是一種廣溫、廣鹽性生物，分布在世界多個海域。這種藻之所以被廣泛研究，因為它在赤潮形成時會產生魚毒素，嚴重破壞海洋生態系統，導致大量人工養殖魚類死亡。然而，關于藻華形成和毒素產生機制仍不清楚，為了更好地了解赤潮異彎藻如何形成藻華、形成藻華時如何殺死魚類，有關分子機制或調節該物種生長和新陳代謝的生化過程的信息是非常重要的。

基于DNA的分子生物學方法是研究生物特征的有效方法之一。對于分子分析、基因工程，如克隆和DNA測序，所有這些步驟的初始步驟都是DNA提取。目前有很多種DNA提取方法，如十二烷基硫酸鈉(SDS)法，十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法和商業化的DNA提取試劑盒。然而，上述的一些DNA提取方法可能適用于某些特定的生物，但不適用于特定的藻類物種。赤潮異彎藻的基因組較大，很難獲得完整的基因組DNA，因此，得到高濃度、高純度和高完整度的赤潮異彎藻基因組是開展該物種DNA高通量測序技術的先決條件。

從植物和藻類中提取DNA的困難之處在于它們具有獨特的細胞結構。赤潮異彎藻的細胞很脆弱，沒有細胞壁。所以在用離心法收集藻細胞時，細胞會聚集形成細胞團，使藻細胞的完全裂解變得更加困難。雖然勻漿器可以破壞細胞的結構，但是物理操作會降低基因組DNA的完整性，使得這種方法獲得的DNA不適合于基因組測序等下游實驗。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術的缺陷，提出了一種從赤潮異彎藻細胞中提取高質量DNA的方法，以解決上述背景技術提出的問題。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：一種從赤潮異彎藻細胞中提取高質量DNA的方法，包括如下步驟：

S1:藻細胞的培養：用于配制藻培養液的海水經0.22μm的濾膜過濾，并經高壓滅菌，鹽度為30PSU；

S2:藻細胞裂解緩沖液的篩選：采用SDS處理法和CTAB提取法獲得高質量的DNA；首先從培養基中獲取藻細胞，然后將細胞顆粒分別懸浮在SDS和CTAB細胞裂解液中；

S3:收集藻細胞：使用0.3μm的PVDF過濾膜，然后將過濾膜轉移到0.8mL于60℃預熱的CTAB細胞裂解液(2％CTAB,100mMTris-HClpH8.0,1.4MNaCL,0.2％β巰基乙醇，0.1mg/ml蛋白酶K)中，用剪刀將過濾膜剪碎，用封口膜密封離心管管口，60℃孵育2小時，不時輕輕地顛倒混勻，樣品在12000rpm離心15s后，將細胞裂解液轉移到新的離心管中；

S4:添加800μL的氯仿至細胞液中，輕輕地顛倒離心管2分鐘使其混勻，在室溫下靜置2分鐘后，4℃，12000rpm離心10分鐘；

S5:轉移上層水相至新的離心管中，添加RNA酶，37℃溫育30分鐘；

S6:加入等體積的氯仿至溫浴后的混合液中，12000rpm離心10分鐘；

S7:將上層水相轉移到另一個新的離心管中，添加1/10體積的醋酸鈉和2/3體積的異丙醇，輕輕顛倒混勻；