[發明專利]一種從赤潮異彎藻細胞中提取高質量DNA的方法

在審

• 申請號: 202010597957.4
• 申請日: 2020-06-28
• 公開（公告）號: CN111607636A
• 公開（公告）日: 2020-09-01
• 發明（設計）人: 胡廣偉;張珍珍;姬南京;申欣;蔡月鳳;覃昊;石一彪;鄧圣賢
• 申請（專利權）人: 江蘇海洋大學
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806
• 代理公司: 北京和聯順知識產權代理有限公司 11621
• 代理人: 閆超良

1.一種從赤潮異彎藻細胞中提取高質量DNA的方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1:藻細胞的培養：用于配制藻培養液的海水經0.22μm的濾膜過濾，并經高溫高壓滅菌，鹽度為30PSU；

S2:藻細胞裂解緩沖液的篩選：采用SDS處理法和CTAB提取法獲得高質量的DNA；首先從培養液中獲取藻細胞，然后將細胞顆粒分別懸浮在SDS和CTAB細胞裂解液中；

S3:收集藻細胞：使用0.3μm的PVDF過濾膜，然后將過濾膜轉移到0.8mL于60℃預熱的CTAB緩沖液中，用剪刀將過濾膜剪碎，用封口膜密封離心管管口，60℃孵育2小時，不時地輕輕顛倒混勻，樣品在12000rpm離心15s后，將細胞裂解液轉移到新的離心管中；

S4:添加800μL的氯仿至細胞裂解液中，輕輕地顛倒離心管2分鐘使其混勻，在室溫下靜置2分鐘后，4℃，12000rpm離心10分鐘；

S5:轉移上層水相至新的離心管中，添加RNA酶，37℃溫浴30分鐘；

S6:加入等體積的氯仿至溫浴后的混合液中，12000rpm離心10分鐘；

S7:將上層水相轉移到另一個新的離心管中，添加1/10體積的醋酸鈉和2/3體積的異丙醇，輕輕地顛倒混勻；

S8:室溫下，靜置10分鐘，4℃，12000rpm，離心5分鐘。去掉上清，用70％的無水乙醇洗滌2次，吸掉無水乙醇，室溫晾干；最后，將干燥后的DNA樣品重新懸浮于100μL無菌水中，用0.6％的瓊脂糖凝膠進行電泳；

S9:DNA濃度、純度和完整性的分析：采用超微量分光光度計定量測定DNA濃度。

2.根據權利要求1所述的一種從赤潮異彎藻細胞中提取高質量DNA的方法，其特征在于：所述S1中的培養藻細胞的培養基是不添加硅元素的f/2培養基，在20℃培養條件下培養，藻細胞濃度是使用Sedgwick-Rafter計數板在顯微鏡下進行細胞計數，后計算細胞濃度。

3.根據權利要求2所述的一種從赤潮異彎藻細胞中提取高質量DNA的方法，其特征在于：所述藻細胞濃度的計算公式為：C_A＝DR*G*50，其中C_A表示藻細胞濃度；DR表示數藻時藻培養液的稀釋倍數；G表示藻細胞數的平均值。

4.根據權利要求1所述的一種從赤潮異彎藻細胞中提取高質量DNA的方法，其特征在于：所述S2中使用SDS裂解藻細胞的具體步驟：

S2-1-1：離心收集藻細胞，細胞顆粒懸浮于SDS裂解液(0.1M EDTA,1％SDS)中，細胞懸液于56℃孵育過夜；

S2-1-2：將等體積的氯仿加入到細胞裂解液中，輕輕顛倒混勻。于4℃，12000rpm，離心10分鐘，小心地將上清轉移到新的離心管中，加入1/10體積的NaAc和2/3體積的異丙醇；

S2-1-3：將混勻的細胞裂解液在室溫下靜置10分鐘后于4℃，12000rpm，離心5分鐘，收集DNA，用70％的無水乙醇洗滌DNA兩次后晾干，后在無菌水中溶解DNA。

5.根據權利要求1所述的一種從赤潮異彎藻細胞中提取高質量DNA的方法，其特征在于：所述S2中使用CTAB裂解藻細胞的具體步驟：

S2-2-1：在0.5ml DNA裂解緩沖液(10mM Tris，pH 8.0；100mM EDTA，pH 8.0；0.5％SDS和200μg/ml的蛋白酶K)中于55℃孵育5小時；添加82.5μL5M NaCl，終濃度為0.7M；

S2-2-2：然后添加82.5μL提前預熱的10％(w/v)CTAB溶液至混合液中，渦旋1分鐘后在56℃條件下溫育10分鐘；

S2-2-3：添加600μL的氯仿，12000rpm，離心10分鐘，將上層水相轉移到新的離心管中，然后在每個DNA樣品中加入2倍體積的DNA緩沖液，其余步驟與Zymo的DNA純化和濃縮試劑盒方法相同。

6.根據權利要求1所述的一種從赤潮異彎藻細胞中提取高質量DNA的方法，其特征在于：所述S9中測定DNA濃度的方法：根據在230、260和280nm處的吸光度值，用Nanodrop定量測定核酸的純度，并計算260/280和260/230的比值，用優化后的方法提取赤潮異彎藻的基因組DNA，經0.6％瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性，用凝膠核酸染色法觀察DNA條帶。