[發明專利]一種多功能3D重組皮膚模型的低溫保存方法

有效

• 申請號: 202010596018.8
• 申請日: 2020-06-28
• 公開（公告）號: CN111631212B
• 公開（公告）日: 2021-12-24
• 發明（設計）人: 李霄;邢志青;張甜甜;王杰;張平;鄭海陽
• 申請（專利權）人: 濟南磐升生物技術有限公司
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02;C12N5/071
• 代理公司: 濟南誠智商標專利事務所有限公司 37105
• 代理人: 房一粟

本發明公開了一種多功能3D重組皮膚模型的低溫保存方法，本發明首次將細胞松弛素B應用于皮膚模型的固體保存中，采用三步法進行處理，該處理方法可以維持模型在運輸過程中的細胞活性，減少細胞缺氧性損傷，以保證3D重皮膚組模型測試的準確性和細胞的活力，并極大程度延長保存時間。

技術領域

本發明涉及一種多功能3D重組皮膚模型的低溫保存方法，屬于生物醫學領域。

背景技術

隨著體外器官培養基體外替代技術的發展，基于3D體外細胞培養構建的3D重組皮膚模型在刺激性試驗安全性及有效性評價方面表現出特有的趨勢。體外構建的3D表皮模型類似于人體皮膚結構，可以用于化妝品檢測的體外替代試驗；體外構建的3D全層皮膚是具有活細胞的組織工程皮膚，具有表皮層和真皮層，可以參與創面與傷口的修復，可用于由多種原因引起的皮膚缺損的修復，加快皮膚創傷的愈合，并形成功能性的皮膚，以此來減輕患者疼痛，提高患者的生活質量。

但是，由于體外3D重組皮膚模型的特點，要求模型具有穩定性，并且在長距離運輸過程中能夠很好的保持其原有的特性，以期能夠測試并檢驗出化學物質或其他因素對其影響，從而得到準確的結果。而全層皮膚用于臨床上也需要克服異地運輸的困難，以保證運輸后的皮膚具有一定的活性，從而確保臨床應用的效果。目前關于適用于低溫保存運輸皮膚模型及組織工程皮膚的固體培養基已有相關報道(如中國專利201410418456.X，201510697694.3，201510697887.9)，但目前固體保存仍有較大局限性，其保存時間仍為限制性因素。

細胞松弛素B具有多種生物學功能，尤其是對于微絲結構的影響，它作為冷凍保護劑，可以增加細胞骨架彈性，這對于我們進行低溫保存而言至關重要，目前已有中國專利201410418456.X將細胞松弛素B添加于保存液中，但迄今為止，已報道的文獻中關于細胞松弛素B的利用均發生在液體環境中，并且劑量添加和處理時間長短的差異對細胞或組織都會產生巨大影響。由于固體保存較液體保存溶液流動性差，許多分子運動受限，致使物質交換能力降低，這在很大程度上限制了固體保存時限的延長。

發明內容

本發明克服了上述現有技術的不足，提供一種多功能3D重組皮膚模型的低溫保存方法，本發明首次將細胞松弛素B應用于皮膚模型的固體保存中，該處理方法可以維持模型在運輸過程中的細胞活性，減少細胞缺氧性損傷，以保證3D重皮膚組模型測試的準確性和細胞的活力，并極大程度延長保存時間。

一種多功能3D重組皮膚模型的低溫保存方法，包括如下步驟：

1)利用細胞培養技術培養3D重組皮膚模型；

2)在步驟1)培養的3D重組皮膚模型處于培養末期時更換細胞培養液，換液后在培養液中添加細胞松弛素B，添加的細胞松弛素B在培養液中的終濃度為0.1-5ug/ml，37℃處理1-24h；

3)將經過步驟2)處理的3D重組皮膚模型置于改良的液體保存液中，4℃預冷0.5h-12h；

4)配制改良的固體培養基，將獲得的固體培養基加入經過步驟3)處理過的3D重組皮膚模型外部，凝固后放入無菌包裝袋中封口。

進一步的，上述步驟2)中所述的細胞培養液是以基礎培養基為主體添加生長因子的培養液；

所述基礎培養基為DMEM、F12或DMEM和F12復配的混合液，所述DMEM和F12復配的混合液中DMEM和F12體積比為4:1-12。

所述生長因子包括氫化可的松、腺嘌呤、ITT、L-谷氨酰胺、EOP(乙醇胺和催化磷脂酰乙醇胺)、人表皮生長因子(hEGF)、牛垂體提取物(BPE)、硒、胎牛血清。