[發明專利]一種多功能3D重組皮膚模型的低溫保存方法

有效

• 申請號: 202010596018.8
• 申請日: 2020-06-28
• 公開（公告）號: CN111631212B
• 公開（公告）日: 2021-12-24
• 發明（設計）人: 李霄;邢志青;張甜甜;王杰;張平;鄭海陽
• 申請（專利權）人: 濟南磐升生物技術有限公司
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02;C12N5/071
• 代理公司: 濟南誠智商標專利事務所有限公司 37105
• 代理人: 房一粟

1.一種多功能3D重組皮膚模型的低溫保存方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)利用細胞培養技術培養3D重組皮膚模型；

2)在步驟1)培養的3D重組皮膚模型處于培養末期時更換細胞培養液，換液后在培養液中添加細胞松弛素B，添加的細胞松弛素B在培養液中的終濃度為0.1-5ug/ml，37℃處理1-24h；

3)將經過步驟2)處理的3D重組皮膚模型置于改良的液體保存液中，4℃預冷0.5h-12h；

4)配制改良的固體培養基，將獲得的固體培養基加入經過步驟3)處理過的3D重組皮膚模型外部，凝固后放入無菌包裝袋中封口，所述的改良的固體培養基由瓊脂糖溶液與改良的液體保存液按照體積比1:1混合均勻后凝固而成；

步驟3)中所述的改良的液體保存液的制備方法包括如下步驟：

S1配制細胞培養液；

S2在步驟S1獲得的細胞培養液中添加細胞松弛素B、海藻糖、蔗糖、甘氨酸、丙氨酸、腺苷、維生素C、維生素E、透明質酸、硫酸軟骨素、去鐵胺、1,6-二磷酸果糖，即可獲得改良的液體保存液。

2.如權利要求1所述的保存方法，其特征在于，步驟2)中所述的細胞培養液是以基礎培養基為主體添加生長因子的培養液；

所述基礎培養基為DMEM、F12或DMEM和F12復配的混合液，所述DMEM和F12復配的混合液中DMEM和F12體積比為4:1-12；

所述生長因子包括氫化可的松、腺嘌呤、ITT、L-谷氨酰胺、EOP、人表皮生長因子、牛垂體提取物、硒、胎牛血清。

3.如權利要求2所述的保存方法，其特征在于，所述氫化可的松在基礎培養基中的終濃度為0.1～2ug/ml、所述腺嘌呤在基礎培養基中的終濃度為10～30mM、所述ITT在基礎培養基中的終濃度為5.0～10.0ug/ml，所述L-谷氨酰胺的濃度為30～60mM，所述EOP在基礎培養基中的終濃度為1～10mM，所述人表皮生長因子在基礎培養基中的終濃度為0.1～1ng/ml，所述硒在基礎培養基中的終濃度為10^-3～0.1nM，所述牛垂體提取物在基礎培養基中的終濃度為0.1～2ug/ml，所述胎牛血清在基礎培養基中的體積分數為2～10％。

4.如權利要求1所述的保存方法，其特征在于，步驟S2中所述細胞松弛素B在液體保存液中的終濃度1-2ug/ml，所述海藻糖在液體保存液中的終濃度為1～20mM，所述蔗糖在液體保存液中的終濃度為50～100mM，所述甘氨酸在液體保存液中的終濃度為1～20mM，所述丙氨酸在液體保存液中的終濃度為1～10mM，所述腺苷在液體保存液中的終濃度為1～10mM，所述維生素E在液體保存液中的終濃度為10mM～30mM，所述維生素C在液體保存液中的終濃度為10mM～40mM，所述去鐵胺在液體保存液中的終濃度為1mM～10mM，所述1,6-二磷酸果糖在液體保存液中的終濃度為1～15mM、所述透明質酸在液體保存液中的體積分數為0.01～1％、所述硫酸軟骨素在液體保存液中的終濃度為0.5～2g/L。

5.如權利要求1所述的保存方法，其特征在于，所述瓊脂糖溶液的濃度為0.25％～5％，所述瓊脂糖為低熔點瓊脂糖，熔點為60～70℃，凝固溫度為28℃～32℃。