[發(fā)明專利]一種多功能3D重組皮膚模型的低溫保存方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010596018.8
• 申請日: 2020-06-28
• 公開（公告）號: CN111631212B
• 公開（公告）日: 2021-12-24
• 發(fā)明（設計）人: 李霄;邢志青;張?zhí)鹛?/a>;王杰;張平;鄭海陽
• 申請（專利權(quán)）人: 濟南磐升生物技術有限公司
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02;C12N5/071
• 代理公司: 濟南誠智商標專利事務所有限公司 37105
• 代理人: 房一粟

1.一種多功能3D重組皮膚模型的低溫保存方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)利用細胞培養(yǎng)技術培養(yǎng)3D重組皮膚模型；

2)在步驟1)培養(yǎng)的3D重組皮膚模型處于培養(yǎng)末期時更換細胞培養(yǎng)液，換液后在培養(yǎng)液中添加細胞松弛素B，添加的細胞松弛素B在培養(yǎng)液中的終濃度為0.1-5ug/ml，37℃處理1-24h；

3)將經(jīng)過步驟2)處理的3D重組皮膚模型置于改良的液體保存液中，4℃預冷0.5h-12h；

4)配制改良的固體培養(yǎng)基，將獲得的固體培養(yǎng)基加入經(jīng)過步驟3)處理過的3D重組皮膚模型外部，凝固后放入無菌包裝袋中封口，所述的改良的固體培養(yǎng)基由瓊脂糖溶液與改良的液體保存液按照體積比1:1混合均勻后凝固而成；

步驟3)中所述的改良的液體保存液的制備方法包括如下步驟：

S1配制細胞培養(yǎng)液；

S2在步驟S1獲得的細胞培養(yǎng)液中添加細胞松弛素B、海藻糖、蔗糖、甘氨酸、丙氨酸、腺苷、維生素C、維生素E、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、去鐵胺、1,6-二磷酸果糖，即可獲得改良的液體保存液。

2.如權(quán)利要求1所述的保存方法，其特征在于，步驟2)中所述的細胞培養(yǎng)液是以基礎培養(yǎng)基為主體添加生長因子的培養(yǎng)液；

所述基礎培養(yǎng)基為DMEM、F12或DMEM和F12復配的混合液，所述DMEM和F12復配的混合液中DMEM和F12體積比為4:1-12；

所述生長因子包括氫化可的松、腺嘌呤、ITT、L-谷氨酰胺、EOP、人表皮生長因子、牛垂體提取物、硒、胎牛血清。

3.如權(quán)利要求2所述的保存方法，其特征在于，所述氫化可的松在基礎培養(yǎng)基中的終濃度為0.1～2ug/ml、所述腺嘌呤在基礎培養(yǎng)基中的終濃度為10～30mM、所述ITT在基礎培養(yǎng)基中的終濃度為5.0～10.0ug/ml，所述L-谷氨酰胺的濃度為30～60mM，所述EOP在基礎培養(yǎng)基中的終濃度為1～10mM，所述人表皮生長因子在基礎培養(yǎng)基中的終濃度為0.1～1ng/ml，所述硒在基礎培養(yǎng)基中的終濃度為10^-3～0.1nM，所述牛垂體提取物在基礎培養(yǎng)基中的終濃度為0.1～2ug/ml，所述胎牛血清在基礎培養(yǎng)基中的體積分數(shù)為2～10％。

4.如權(quán)利要求1所述的保存方法，其特征在于，步驟S2中所述細胞松弛素B在液體保存液中的終濃度1-2ug/ml，所述海藻糖在液體保存液中的終濃度為1～20mM，所述蔗糖在液體保存液中的終濃度為50～100mM，所述甘氨酸在液體保存液中的終濃度為1～20mM，所述丙氨酸在液體保存液中的終濃度為1～10mM，所述腺苷在液體保存液中的終濃度為1～10mM，所述維生素E在液體保存液中的終濃度為10mM～30mM，所述維生素C在液體保存液中的終濃度為10mM～40mM，所述去鐵胺在液體保存液中的終濃度為1mM～10mM，所述1,6-二磷酸果糖在液體保存液中的終濃度為1～15mM、所述透明質(zhì)酸在液體保存液中的體積分數(shù)為0.01～1％、所述硫酸軟骨素在液體保存液中的終濃度為0.5～2g/L。

5.如權(quán)利要求1所述的保存方法，其特征在于，所述瓊脂糖溶液的濃度為0.25％～5％，所述瓊脂糖為低熔點瓊脂糖，熔點為60～70℃，凝固溫度為28℃～32℃。