[發(fā)明專利]一種針對(duì)神經(jīng)肌肉病生物醫(yī)藥的監(jiān)測(cè)方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010595922.7
• 申請(qǐng)日: 2020-06-27
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111676284A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-09-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張銀冰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 張銀冰
• 主分類號(hào): C12Q1/6883
• 分類號(hào): C12Q1/6883;C12Q1/6869
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

1.一種針對(duì)神經(jīng)肌肉病生物醫(yī)藥的監(jiān)測(cè)方法，其特征在于：包括以下步驟：

A、提取基因組DNA：提取患者的基因組DNA，并對(duì)提取的基因組DNA進(jìn)行定量操作，然后分別裝入統(tǒng)一規(guī)格的培養(yǎng)皿中；

B、制備捕獲文庫(kù)：①將基因組DNA進(jìn)行片段化，②將片段化的基因組DNA進(jìn)行末端修復(fù)和3’末端添加堿基A，③將3’末端添加堿基A的產(chǎn)物連接擴(kuò)增接頭，④將連接產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，富集有效產(chǎn)物，⑤使用探針對(duì)富集的模板中的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行捕獲，⑥將捕獲的目標(biāo)片段分離，⑦加上完整接頭獲得捕獲文庫(kù)，并對(duì)捕獲到的目標(biāo)序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再對(duì)文庫(kù)進(jìn)行定量操作；

C、高通量測(cè)序：上機(jī)測(cè)序，數(shù)據(jù)分析得到致病位點(diǎn)相關(guān)信息，再使用不同引物序列進(jìn)行前后兩次PCR擴(kuò)增，從而產(chǎn)生更多不同標(biāo)簽的引物；

D、分析總結(jié)：通過(guò)對(duì)所得測(cè)序數(shù)據(jù)與人類基因組的參考序列進(jìn)行對(duì)比，并對(duì)所測(cè)基因的每個(gè)突變位點(diǎn)情況進(jìn)行分析，得到神經(jīng)肌肉病相關(guān)基因突變位點(diǎn)，并總結(jié)所用生物靶向醫(yī)藥中有效成分的作用機(jī)理、指標(biāo)數(shù)據(jù)；

E、橫向比對(duì)：通過(guò)語(yǔ)義分析算法，從關(guān)聯(lián)文獻(xiàn)中提取相關(guān)檢測(cè)結(jié)果，生成所用生物靶向醫(yī)藥的綜合性能評(píng)價(jià)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種針對(duì)神經(jīng)肌肉病生物醫(yī)藥的監(jiān)測(cè)方法，其特征在于：所述步驟A中的提取方法包括純化柱純化、磁珠純化或酚氯仿提取。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種針對(duì)神經(jīng)肌肉病生物醫(yī)藥的監(jiān)測(cè)方法，其特征在于：所述步驟A中的培養(yǎng)皿皆為玻璃材質(zhì)。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種針對(duì)神經(jīng)肌肉病生物醫(yī)藥的監(jiān)測(cè)方法，其特征在于：所述步驟A與步驟B中的定量方法包括基于熒光定量原理的定量裝置定量、Q-PCR定量以及電泳定量。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種針對(duì)神經(jīng)肌肉病生物醫(yī)藥的監(jiān)測(cè)方法，其特征在于：所述步驟B-①中的DNA片段化方法包括超聲破碎、轉(zhuǎn)座酶酶切以及限制性內(nèi)切酶酶切。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種針對(duì)神經(jīng)肌肉病生物醫(yī)藥的監(jiān)測(cè)方法，其特征在于：所述步驟B-④⑦中皆采用DNA聚合酶對(duì)捕獲到的目標(biāo)序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種針對(duì)神經(jīng)肌肉病生物醫(yī)藥的監(jiān)測(cè)方法，其特征在于：所述步驟B-⑤中的探針包括檢測(cè)CLCN1、SCN4A、CACNA1S、KCNJ2、TIA1、GNE、MYH7、NEB、FLNC、SEPN1、POMT2、VCP、DMD、MYOT、LMNA、CAV3、CAPN3、DYSF、SGCG、SGCA、SGCB、SGCD、TCAP、TRIM32、POMT1、ANO5、FKTN、BAG3、AGL、DAG1、PLEC以及EMD的探針。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種針對(duì)神經(jīng)肌肉病生物醫(yī)藥的監(jiān)測(cè)方法，其特征在于：所述步驟C中第一次PCR擴(kuò)增所采用的引物序列如下，

Primer F：

5’-ACACTCTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’；

Primer R：

5’-GTACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種針對(duì)神經(jīng)肌肉病生物醫(yī)藥的監(jiān)測(cè)方法，其特征在于：所述步驟C中第二次PCR擴(kuò)增所采用的引物序列如下，

TrueSeq Universal Primer：

5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’；

TrueSeq Primer-Index X：

5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’。