[發明專利]唐菖蒲伯克霍爾德氏菌熒光定量PCR內參基因及其引物的篩選和應用

有效

• 申請號: 202010595646.4
• 申請日: 2020-06-28
• 公開（公告）號: CN111705149B
• 公開（公告）日: 2022-02-15
• 發明（設計）人: 李曉丹;汪仁;徐晟;王蓉;江玉梅;周正雄;李宜奎;王松鳳
• 申請（專利權）人: 江蘇省中國科學院植物研究所
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6851;C12Q1/6809;G16B40/00;G16B25/10;G16B25/20;G16B30/10;G16B20/00;G16B20/20;C12R1/01
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本發明公開了唐菖蒲伯克霍爾德氏菌實時熒光定量PCR（qRT?PCR）內參基因及其引物的篩選和應用。根據已獲得的轉錄組分析結果及已報道的內參基因，初步篩選表達相對較為穩定的12個候選內參基因，基因名分別為：atpD、clpP、clpX、ftsZ、gyrB、lpxC、pyrG、recA、rpoB、rpoD、thyA和16S；針對上述候選基因，設計擴增引物，對唐菖蒲伯克霍爾德氏菌不同培養條件下（溫度、培養基初始pH值、培養時間、不同濃度NaCl處理）的內參基因進行篩選，采用geNorm、NormFinder和Bestkeeper軟件對qRT?PCR結果進行分析，最終篩選到在不同培養條件和NaCl處理條件下最穩定表達的內參基因。本發明有利于不同條件下唐菖蒲伯克霍爾德氏菌基因表達分析研究的穩定性和可靠性。

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，具體涉及唐菖蒲伯克霍爾德氏菌實時熒光定量PCR內參基因及其引物的篩選與應用。

背景技術

伯克霍爾德氏菌(Burkholderia)是一種革蘭氏陰性棒狀細菌，廣泛存在于水、土壤、植物體和人體等環境中。伯克霍爾德氏菌在農業上可作生物降解、生防及促進植物生長之用。部分伯克霍爾德氏菌可合成小分子抗菌物質——毒黃素，毒黃素具有良好的腫瘤細胞抑制活性和抗真菌活性(特別是對唑類藥物耐藥煙曲霉的抑制活性)，是一種具有良好應用前景的化合物，在進行結構修飾后可作為候選藥物應用。唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(Burkholderia gladioli)HDXY-02具有高產毒黃素的特性，作為生物合成毒黃素的生產菌株具有重要的現實意義。研究過程中發現B.gladioli HDXY-02和另一株購自中國工業微生物菌種保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection,CICC)的B.gladioli CICC 10574的毒黃素合成能力具有顯著差異，B.gladioli CICC 10574幾乎不產毒黃素。轉錄組測序發現兩株菌毒黃素合成相關基因的表達量存在顯著差異，但是需要進行進一步的驗證。

實時熒光定量PCR(qRT-PCR)具有操作簡單，成本較低，靈敏度高的優勢，經常被用于目的基因的轉錄水平研究和轉錄組數據的驗證。qRT-PCR實驗需要表達穩定的管家基因作為內參。但是，在不同的實驗條件下，內參基因RNA表達水平并不穩定，僅根據文獻中常用的內參基因進行基因表達水平分析可能會使實驗結果產生偏差。在進行基因的表達量分析時，需要根據各自研究的需要來選擇合適的內參基因。因此，從多種內參基因中篩選出B.gladioli HDXY-02與B.gladioli CICC 10574中穩定表達的內參基因十分必要。內參基因的確定對于準確分析B.gladioli不同菌株中基因的表達差異研究十分關鍵。本發明對B.gladioli HDXY-02和B.gladioli CICC 10574的內參基因進行了篩選，旨在找到B.gladioli HDXY-02和B.gladioli CICC 10574中最穩定的內參基因，為后續不同B.gladioli菌株的基因表達分析及轉錄調控機制研究奠定基礎，為進一步提高B.gladioliHDXY-02的毒黃素產量提供依據。

發明內容

本發明的目的在于提供不同培養條件和不同濃度NaCl處理下，B.gladioli菌株實時熒光定量PCR(qRT-PCR)的內參基因及其引物。