[發(fā)明專利]高純度抗蛇毒血清及其制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010594081.8
• 申請日: 2020-06-24
• 公開（公告）號: CN111748031B
• 公開（公告）日: 2021-12-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 方凱萍;劉海昌;朱復(fù)培;楊乾敏;時樂
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江毓昌生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C07K16/00
• 分類號: C07K16/00;C07K1/22
• 代理公司: 杭州天昊專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 33283
• 代理人: 趙志鵬

1.一種高純度抗五步蛇毒血清的制備方法，其特征在于包括：a）溴化氰活化多糖類載體，b) 五步蛇毒素偶聯(lián)溴化氰活化多糖類載體，c) 采用親和層析的方法提純抗五步蛇毒血清F(ab’)2；

其中，所述a）溴化氰活化多糖類載體的步驟為：溴化氰溶于丙酮并配制成1M濃度，取所需量溴化氰溶液加入到多糖類載體同時快速攪拌，在3分鐘之內(nèi)滴加溶于60%丙酮溶液中濃度為0.5-3.0M 有機堿中，滴加完畢后攪拌1-5分鐘，攪拌結(jié)束后反應(yīng)物立即倒入冰浴制冷的洗滌溶液中，置冰箱保存，其中，所述洗滌溶液中丙酮：0.1M鹽酸為1:1；

所述有機堿為三乙胺（TEA）、二甲氨基吡啶（DAP）中的一種或它們的混合物；

所述b)五步蛇毒素偶聯(lián)溴化氰活化多糖類載體的步驟為：用pH7.0-8.0 10-200 mM磷酸鈉、150 mM氯化鈉緩沖液洗滌步驟a）中得到的溴化氰活化多糖類載體后，加入五步蛇毒素，在室溫中震搖反應(yīng)2-6小時，然后用pH7.0-8.0的10-200 mM磷酸鈉、150 mM氯化鈉及100mM甘氨酸緩沖液洗滌凝膠并留置；

所述五步蛇毒素用乙二胺四乙酸(EDTA) 及苯甲基磺酰氟(PMSF)處理的五步蛇毒素；

所述c)采用親和層析的方法提純抗五步蛇毒血清F(ab’)2的步驟為：首先將步驟b）中得到的五步蛇毒素偶聯(lián)溴化氰活化多糖類載體裝入層析柱，第二步是上樣，樣品為抗五步蛇毒血清，第三步是用洗滌緩沖液洗滌，第四步是用洗脫緩沖液洗脫蛋白。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高純度抗五步蛇毒血清的制備方法，其特征在于：所述多糖類載體為瓊脂糖凝膠。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的高純度抗五步蛇毒血清的制備方法，其特征在于：所述多糖類載體為2%-6%瓊脂糖濃度的凝膠。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的高純度抗五步蛇毒血清的制備方法，其特征在于：所述多糖類載體為4%瓊脂糖濃度的凝膠。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的高純度抗五步蛇毒血清的制備方法，其特征在于：所述多糖類載體為Sepharose CL4B FF或Bestarose 4B的一種或它們的混合物。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高純度抗五步蛇毒血清的制備方法，其特征在于：所述有機堿濃度為1.0-2.0M。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的高純度抗五步蛇毒血清的制備方法，其特征在于：所述有機堿濃度為1.5M。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高純度抗五步蛇毒血清的制備方法，其特征在于：所述溴化氰(CNBr)的加入量為5mg CNBr/1g凝膠-40mg CNBr/1g凝膠。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的高純度抗五步蛇毒血清的制備方法，其特征在于：所述溴化氰(CNBr)的加入量為10mg CNBr/1g凝膠-30mg CNBr/1g凝膠。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的高純度抗五步蛇毒血清的制備方法，其特征在于：所述溴化氰(CNBr)的加入量為15mg CNBr/1g凝膠-25mg CNBr/1g凝膠。

11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高純度抗五步蛇毒血清的制備方法，其特征在于：所述五步蛇毒素中的蛋白濃度為5-50 mg/ml。

12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的高純度抗五步蛇毒血清的制備方法，其特征在于：五步蛇毒素中的蛋白濃度為10-40 mg/ml。

13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的高純度抗五步蛇毒血清的制備方法，其特征在于：五步蛇毒素中的蛋白濃度為15-25 mg/ml。