[發明專利]一種新型冠狀病毒核酸檢測引物探針組合物、試劑盒及方法

在審

• 申請號: 202010588373.0
• 申請日: 2020-06-24
• 公開（公告）號: CN111621604A
• 公開（公告）日: 2020-09-04
• 發明（設計）人: 方耀東;陳林;李明陽;韓麗;張文學;古迪
• 申請（專利權）人: 上海五色石醫學研究股份有限公司;上海五色石醫學科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 杭州創信知識產權代理有限公司 33383
• 代理人: 吳清珠

本發明涉及生物技術及醫學檢驗技術領域，為解決傳統病毒核酸檢測方法準確度低、特異性差，靈敏度低的問題，提供了一種新型冠狀病毒核酸檢測引物探針組合物、試劑盒及方法，所述新型冠狀病毒核酸檢測引物探針組合物，包括：第一引物探針組，包括正向引物ORF1ab?F，探針ORF1ab?P和反向引物ORF1ab?R；第二引物探針組，包括正向引物N?F，探針N?P和反向引物N?R；第三引物探針組，包括正向引物Rpp30?F，探針Rpp30?P和反向引物Rpp30?R。本發明的引物探針組合物通過擴增引物對及檢測探針的巧妙設計，避免了多個引物對及對應的檢測探針之間的相互干擾；試劑盒結構簡單，通過內標對待測樣本的采集、運輸和提取過程中進行監控，避免檢測結果的假陰性。

技術領域

本發明涉及生物技術及醫學檢驗技術領域，尤其涉及一種新型冠狀病毒核酸檢測引物探針組合物、試劑盒及方法。

背景技術

新型冠狀病毒(COVID-19)是一種具有包膜的正鏈單股RNA冠狀病毒，此病毒每組基因組長度約30000個核苷酸左右，與SARS-CoV同屬于冠狀病毒譜系B(BetacoronavirusLineage B，Sarbecovirus)。與SARS-CoV類似，COVID-19可以借由人類的ACE2作為受體結合，通過呼吸道上皮細胞進入肺部進行復制過程，且主要作用對象也是與SARS-CoV相同的T淋巴細胞。其主要是通過與感染人員之間無防護的密切接觸和飛沫傳播，也可能會通過氣溶膠傳播?；九R床癥狀以發熱、干咳、乏力為主要表現。少數患者伴有鼻塞、流涕、咽痛、肌痛和腹瀉等癥狀。重癥患者多發現于發病一周后出現呼吸困難和/或低氧血癥，嚴重者可快速進展成為急性呼吸窘迫綜合征、膿毒癥休克、難以糾正的代謝性酸中毒和凝血功能障礙及多器官功能衰竭?；谀壳暗牧餍胁W調查，潛伏期1～14天，多為3～7天。該病毒所有人易感，暫無特效藥。由于其高致死率和可能與其他病毒引起的感冒和肺炎癥狀相似，不利于疾病的防控和治療，所以設計一種快速、準確、高通量的專門用于鑒別診斷該病毒的診斷試劑盒對社會意義重大。

新型冠狀病毒是RNA病毒，故其提取和保存過程容易破壞病毒核酸，導致檢測出現假陰性。再者由于病毒的高變異性，如果引物探針設計不合理會造成假陰性。現有的病毒核酸檢測方法主要有以下幾種：

熒光定量PCR法，主要用于體外定性檢測病毒核酸，其樣本主要為鼻咽拭子、肺泡灌洗液、痰液、肛拭子、糞便等。從樣本提取到確認檢測結果一般4～5小時。其具有靈敏度高，假陽性、假陰性率相對較低；有專家共識；窗口期相對較短；直接針對目標病毒且可以通過相對豐度來判斷病毒感染的程度和用藥后的效果等優勢。

測序法，該方法相對于PCR法時間更長，對實驗室和專業的要求更高，檢測成本更高，更利于對毒株的變異研究。恒溫擴增法在檢測時間上比PCR略短，靈敏度高，但其對引物的設計要求較高，整個行業發展和配套還不如PCR成熟，需要專業人員和設備，且具有更高的假陽性率。膠體金和化學發光法主要的檢測物為血液中特異性的抗體，在臨床上其具有檢測時間短、速度快、檢測成本較低的特點和檢測窗口期較長的劣勢。膠體金法具有不依賴專業人員和設備，操作簡單的優勢，也存在特異性差，靈敏度低，假陰性、假陽性率高的缺點。化學發光法相較于膠體金法靈敏度更高，但需要專門的設備和人員。

雖然熒光定量PCR法檢測新型冠狀病毒具有速度快、通量大、通用性強和配套成熟的優勢，但是其存在對人員專業要求高，需要專業的設備和實驗室，檢測成本高，樣本需長距離運輸容易破壞病毒核酸等劣勢。

發明內容

本發明為了克服傳統病毒核酸檢測方法準確度低、特異性差，靈敏度低的問題，提供了一種準確度高、特異性好，靈敏度高的新型冠狀病毒核酸檢測引物探針組合物，避免了多個引物對及對應的檢測探針之間的相互干擾。

本發明還提供了一種新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒。

本發明還提供了一種新型冠狀病毒核酸檢測方法，該方法特異性高、準確度高、靈敏度高。

為了實現上述目的，本發明采用以下技術方案：