[發明專利]一種用于幽門螺桿菌根除治療中個性化用藥指導的快速分子診斷方法及試劑盒

在審

• 申請號: 202010588092.5
• 申請日: 2020-06-24
• 公開（公告）號: CN111705148A
• 公開（公告）日: 2020-09-25
• 發明（設計）人: 郗日沫;佟悅;王倍;王朔;張瑞肖;楊坤
• 申請（專利權）人: 南開大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6848
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明創造涉及一種檢測和判定胃活檢樣本中幽門螺桿菌耐藥性的診斷方法和試劑盒，本方法僅需簡單的直接對患者活檢樣本進行全基因組提取，即可進行下游PCR反應。采用核苷酸序列如圖2、3所示的23對引物聯合檢測23SrRNA、gyrA、PBP1、16SrRNA、porD、oorD、rpoB及rdxA 8種耐藥基因的常見突變位點的101個突變型和宿主藥物代謝酶CYP2C19基因的兩個突變型，對目前臨床常用7種抗生素耐藥基因和藥物代謝酶基因的突變情況通過巢式PCR技術結合測序技術進行快速檢測與準確解析，特異性與準確性較高，此診斷方法相較傳統藥敏培養實驗，檢測更為快速靈敏，更適合于臨床應用，在指導幽門螺桿菌陽性患者的個性化診療方面有較大臨床應用前景。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種以胃活檢組織為樣本檢測和判定幽 門螺旋桿菌耐藥性的診斷方法及試劑盒。

背景技術

幽門螺桿菌是革蘭氏陰性螺旋微需氧菌，在全球約50-70％的人口中定植在 胃上皮中，在發展中國家，感染率已達到90％，并且存在一定的地理差異。幽 門螺桿菌最早是在1980年代初期由Marshall和Warren在胃活檢中發現的，被 認為是導致慢性胃炎，消化性潰瘍，胃癌的主要誘因。根除療法可以減少細菌的 傳播，防止胃癌的發展，并減少其他相關疾病的風險。

因為幽門螺桿菌定位于胃粘膜的酸性表面，所以需要一種酸性抑制劑(通常 是質子泵抑制劑PPI)來維持恒定的pH值，從而提高抗生素的療效。目前幽門螺 桿菌的根除治療方案主要包括質子泵抑制劑(PPI)和胃黏膜保護劑以及一種或 兩種抗生素，可進行三聯或四聯治療，然而，在一些地區，標準三聯療法根除率 已低于《馬斯特里赫特條約》(MaastrichtConsensus)的80％，含氟喹諾酮類藥 物治療已作為二線或三線治療用于搶救治療。不幸的是，幽門螺桿菌對氟喹諾酮 類藥物的耐藥性最近也有所增加，Hp對一線抗生素的耐藥率(包括多重耐藥率) 呈逐年上升趨勢，目前抗生素耐藥性已成為成功根除幽門螺桿菌的關鍵。我國第 5次Hp感染處理共識提出如需選擇含克拉霉素、甲硝唑或左氧氟沙星的任何方 案，均建議根除前應進行藥物敏感試驗，以便指導合適藥物的選擇。

根除失敗的其他因素是治療的依從性和宿主遺傳因素，后者可能影響PPI 藥代動力學。在根除過程中質子泵抑制劑起著至關重要的作用，它抑制胃酸分泌， 將pH值提高至6.0以上，提高了抗菌藥物活性和濃度。質子泵抑制劑的作用取 決于細胞色素P450(CYP)酶的代謝。研究表明，CYP2C19基因型可能影響質子 泵抑制劑以抑制胃酸分泌的能力。CYP2C19等位基因在不同種族的人群中分布差 異很大，例如CYP2C19*2在中國人群中為30％，所以對CYP2C19基因多態性進 行檢測十分必要。

用于根除幽門螺桿菌的抗生素包括克拉霉素(CAM)，左氧氟沙星(LVX)， 阿莫西林(AMX)，四環素(TET)，利福平(RIF)，呋喃唑酮(FUR)和甲硝唑 (MTZ)等。

目前已有單一或多種抗生素耐藥基因的檢測方法，但是常用的仍為藥敏實驗 即胃活檢組織中幽門螺桿菌的分離培養，由于胃中幽門螺桿菌分布不均勻，患者 依從性差，而導致胃活檢樣本中幽門螺桿菌含量稀少，培養成功率低。并且因幽 門螺桿菌培養條件苛刻，需要特定儀器且生長緩慢，培養周期較長而不適用于臨 床耐藥性快速診斷與即時用藥指導。

本發明經過前期研究發現，新鮮胃活檢組織樣本直接進行分子診斷與臨床分 離培養菌株進行分子診斷基因型一致率分別為：克拉霉素97.6％、阿莫西林

92.7％、鹽酸左氧氟沙星97.6％、四環素100％、利福平100％、呋喃唑酮90.24％、甲硝唑100％，如表1所示，二者一致率較高，因此本發明提出新鮮胃活檢組織 樣本可直接用于基因組提取，繼而應用于下游分子診斷。