[發(fā)明專利]一種攜帶凋亡素的外泌體及其應(yīng)用

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202010587949.1
• 申請日: 2020-06-24
• 公開（公告）號: CN111778214A
• 公開（公告）日: 2020-10-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 郝瑞峰
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/85;C12N15/49;A61K48/00;A61K38/16;A61P35/00
• 代理公司: 北京思創(chuàng)大成知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11614
• 代理人: 高爽

本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種攜帶凋亡素的外泌體及其應(yīng)用。該外泌體的制備方法包括以下步驟：(1)采用帶有酶切位點的引物擴增凋亡素基因，得到含凋亡素基因片段；(2)將含凋亡素基因片段和pEGFP?N1?L載體分別進(jìn)行雙酶切并連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞，得到含凋亡素基因片段的pEGFP?N1?AGL重組質(zhì)粒；(3)將含凋亡素基因片段的pEGFP?N1?AGL重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至非洲綠猴腎成纖維細(xì)胞Cos?7，培養(yǎng)該細(xì)胞，得到外泌體，經(jīng)超速離心法純化，得到所述攜帶凋亡素的外泌體。相比于病毒和多肽載體，外泌體體積小，能夠避開單核吞噬細(xì)胞的快速吞噬，穩(wěn)定地攜帶和運送所包裹的藥物，并順利通過血管內(nèi)皮到達(dá)靶細(xì)胞。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，更具體地，涉及一種攜帶凋亡素的外泌體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

凋亡素(Apoptin)是一種衍生自雞貧血病毒的小分子蛋白，具有廣譜的抗腫瘤特性，在許多人源腫瘤細(xì)胞中都能夠選擇性地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞或轉(zhuǎn)化細(xì)胞凋亡，但對正常的人體二倍體細(xì)胞無影響。凋亡素必須要進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)，才能發(fā)揮誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。由于凋亡素可通過非共價結(jié)合的形式，形成包含30-40個單體的球狀多聚體復(fù)合物，很難穿過細(xì)胞膜進(jìn)入腫瘤細(xì)胞。因此，在應(yīng)用凋亡素進(jìn)行腫瘤治療時，如何將凋亡素制備成一種可以有效穿透細(xì)胞膜的物質(zhì)，就成為需要解決的首要問題。

為解決以上問題，國內(nèi)外目前主要采用兩種方法將凋亡素制備成可穿透細(xì)胞的形式：

一種是將凋亡素基因與基因載體連接，制備成一種新的治療用基因載體，使凋亡素在腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。其中以逆轉(zhuǎn)錄病毒(Retroviruses，RV)、慢病毒(Lentivirus，LV)、腺病毒(Adenovirus，AV)、腺相關(guān)病毒(Adeno-associated virus，AAV)等載體最常用。

另一種是將凋亡素與穿膜載體連接，主要通過將凋亡素與細(xì)胞穿透肽(CellPenetrating Peptides，CPPs)連接，從而制備成一種具有治療功能的重組融合蛋白。

外泌體(Exosome)是一種具有良好穿膜特性的新型穿膜載體。外泌體的膜同細(xì)胞質(zhì)膜一樣，是磷脂雙分子層，具有生物活性，能夠被受體細(xì)胞吸收。近年來，外泌體作為藥物遞送載體成為新的研究熱點。目前尚未有使用外泌體作為凋亡素的載體的相關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是使用外泌體作為載體，將凋亡素蛋白展示在外泌體表面，從而制備出一種新型的具有腫瘤治療功能的外泌體。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的第一方面提供一種攜帶凋亡素的外泌體，其特征在于，該外泌體的制備方法包括以下步驟：

(1)采用帶有酶切位點的引物擴增凋亡素基因，得到含凋亡素基因片段；

(2)將含凋亡素基因片段和pEGFP-N1-L載體分別進(jìn)行雙酶切并連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞，得到含凋亡素基因片段的pEGFP-N1-AGL重組質(zhì)粒，質(zhì)粒圖譜見圖1。

(3)將含凋亡素基因片段的pEGFP-N1-AGL重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至非洲綠猴腎成纖維細(xì)胞Cos-7，培養(yǎng)該細(xì)胞，得到外泌體，經(jīng)超速離心法純化，得到所述攜帶凋亡素的外泌體。

其中，pEGFP-N1-L和pEGFP-N1-AGL中的L表示Lamp2b蛋白(溶酶體相關(guān)膜蛋白2b)，G表示EGFP(增強型綠色熒光蛋白)，A表示凋亡素蛋白。

根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選地，步驟(1)中所述的引物包括序列為SEQ ID NO：1所示的上游引物和序列為SEQ ID NO：2所示的下游引物；

5’-CCGCTCGAGGCATGAACGCGCTGCAGGAAGATACC-3’(SEQ ID NO：1)