[發明專利]一種檢測即食生鮮果蔬中肺炎克雷伯菌的質譜方法

在審

• 申請號: 202010587695.3
• 申請日: 2020-06-24
• 公開（公告）號: CN111876343A
• 公開（公告）日: 2020-11-03
• 發明（設計）人: 魏超;代曉航;劉煒;郭靈安
• 申請（專利權）人: 四川省農業科學院分析測試中心
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N1/02;G01N33/68;G01N27/62;C12R1/22
• 代理公司: 北京勁創知識產權代理事務所(普通合伙) 11589
• 代理人: 曹玉清

本發明涉及一種質譜檢測即食果蔬農產品克雷伯氏菌的方法，包括以下步驟：S1:即食果蔬中肺炎克雷伯菌特異性選擇培養制備；S2:從果蔬中分離肺炎克雷伯菌分離方法的建立；S3:提取果蔬中分離疑似肺炎克雷伯菌蛋白質成分；S4:使用基質解析電離飛行時間質譜收集肺炎克雷伯菌蛋白圖譜，采用特征峰擬合的方法進行鑒定。核心技術為針對即食果蔬的表面的肺炎克雷伯菌選擇性培養基成分研發及分離方法確立、微生物質譜鑒定的前處理方法的建立，微生物質譜條件確立。本發明針對未有標準的農業產品即食果蔬肺炎克雷伯菌進行檢測、鑒定的方法，采用了生化選擇性培養結合質譜方法檢測鑒定即食果蔬中肺炎克雷伯菌，從而對農產品果蔬中的肺炎克雷伯菌進行準確的鑒定，而且獲得到更多果蔬微生物蛋白質數據信息，為果蔬中肺炎克雷伯菌溯源及致病分析提供數據。

技術領域

本發明涉及技術為領域為農產品微生物檢測，質譜法微生物鑒定，更特 別地，為農產品即食生鮮果蔬食源性病原微生物檢測。

背景技術

目前可以進行食源性微生物檢測方法主要有四類，一是傳統常規的檢驗 方法，檢測方法主要包括增菌、分離、生化鑒定等，檢測步驟比較復雜、周 期較長，大至需要5-10天，但傳統方法技術成熟、所需設備簡單，傳統方 法是目前微生物檢測的主流方法，但我國沒有成熟規范的食品中肺炎克雷伯 菌檢測方法。二是分子生物學方法，包括以下幾種技術：單重、多重、熒光 定量等PCR技術、核酸探針技術，生物芯片技術該方法具有靈敏度高、檢測快速的特點，一般用于臨床微生物檢測，現有肺炎克雷伯菌檢測專利PCR檢 測引物組和PCR檢測試劑盒等，但需要的儀器設備昂貴、電泳繁瑣，對檢測 人員的技術要求較高，成本很高。三是免疫學檢測方法，免疫分析法的原理 是：制備待檢微生物的特異抗體，由于抗體的特異反應對微生物進行鑒定， 主要有酶聯免疫試劑盒和膠體金檢測卡兩類。該方法具有非常好的靈敏度和 特異性，現有專利克雷伯菌氏菌外蛋白的抗體的開發ELISA試劑盒和抗體乳 膠微球免疫層析檢測試紙，此方法成本較高，一般用于臨床樣品檢測。四是 其他新興的微生物檢測技術和方法，比如微生物基質輔助激光解析電離飛行 時間質譜分析法，該方法是利用微生物結構蛋白的穩定性和多樣性，進行微 生物菌株水平的鑒定和分型。該方法鑒定微生物主要特點有以下幾方面： (1)獲得結果迅速，準確率高，質譜前處理只需要1h，質譜過程3min就可 獲得結果。(2)可根據分離微生物來源自行建立數據庫，獲得微生物特征性 關鍵信息，提高鑒定額準確率，且根據微生物的分離來源，例如即食果蔬中， 獲得屬于農產品的微生物信息，保留其特異性。

在我國，國家標準中沒有針對果蔬微生物檢測的具體樣品處理方法，現 有文獻也很少有針對果蔬中的肺炎克雷伯菌進行特異性分離檢測，本專利針 對果蔬結構的特殊性和肺炎克雷伯菌的特點設計采用生化的方法分離培養， 然后采用質譜方法進行鑒定，此方法適用于農產品，農產品即食果蔬病原微 生物檢測及食用安全評價提供助力。

發明內容

本發明的目的在于提供一種檢測即食生鮮果蔬中肺炎克雷伯菌的質譜 方法，以解決即食果蔬中肺炎克雷伯菌檢測的問題。

種檢測即食生鮮果蔬中肺炎克雷伯菌的質譜方法，包括即食果蔬中肺炎 克雷伯菌分離培養基及方法，肺炎克雷伯菌質譜鑒定的前處理方法及質譜條 件具體為一下步驟：

S1:即食果蔬中肺炎克雷伯菌特異性選擇培養制備；

S2:從果蔬中分離肺炎克雷伯菌分離方法的建立；

S3:提取果蔬中分離疑似肺炎克雷伯菌蛋白質成分；

S4:使用基質解析電離飛行時間質譜收集肺炎克雷伯菌蛋白圖譜，采用 特征峰擬合的方法進行鑒定。