[發明專利]一種改良酵母上游激活元件及其在魚類中的應用

在審

• 申請號: 202010586965.9
• 申請日: 2020-06-24
• 公開（公告）號: CN111876414A
• 公開（公告）日: 2020-11-03
• 發明（設計）人: 張運生;楊品紅;劉良國
• 申請（專利權）人: 湖南文理學院
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/85;C12N15/67;A01K67/027
• 代理公司: 常德市源友專利代理事務所(特殊普通合伙) 43208
• 代理人: 江妹

本發明公開了一種改良酵母上游激活元件及其在魚類中的應用，是由UAS?1、間隔序列、UAS?2、間隔序列、UAS?3、間隔序列、UAS?4、間隔序列、UAS?5、間隔序列、啟動子依次組成的非重復序列，其中UAS?1、UAS?2、UAS?3、UAS?4、UAS?5的堿基序列均不相同。本發明不僅能夠被GAL4蛋白特異識別，而且其CpG位點不易發生甲基化，增強了魚類中目的基因誘導表達率，從而提高目的蛋白的表達產量，很好的促進GAL4/UAS系統在魚類中的應用。

技術領域

本發明涉及一種改良酵母上游激活元件及其在魚類中的應用，屬于分子生物學領域。

背景技術

GAL蛋白家族在酵母的半乳糖代謝中起著重要作用。GAL4作為GAL蛋白家族的一員，其作用類似于原核生物乳糖操縱子的一個轉錄激活子。酵母中原始的GAL4基因編碼含有881個氨基酸的蛋白，該蛋白主要包括N端的DNA結合域和C端的轉錄激活域（Traven etal., 2006）。上游激活序列UAS（upstream active sequence）是酵母中類似真核生物增強子的一段序列，位于靶基因啟動子的上游，其序列特征為：5'-CGGRNNRCYNYNYNCNCCG-3'（R代表嘌呤，Y代表嘧啶，N代表任意脫氧核苷酸），GAL4因子以同源二聚體的形式特異識別并結合UAS，并促使UAS下游基因的轉錄表達（Giniger et al., 1985）。

轉基因技術是研究基因功能的有力工具，但是以往的利用特異性啟動子或熱休克蛋白啟動子驅動外源基因表達的方法具有一定的局限性，比如研究的基因如果是致死基因，那么就無法建立轉基因家系。利用GAL4/UAS系統，可以分別建立含有GAL4的家系和UAS驅動靶基因表達的家系，只有這兩種家系雜交才能調控靶基因的表達，因此GAL4/UAS系統在轉基因技術中的應用，可以彌補上述不足。在GAL4/UAS系統的推廣應用中，GAL4因子被逐步的改造和優化，使之具有更好的誘導精度和和誘導效率。GAL4蛋白之所以能夠特異結合并誘導UAS下游基因的轉錄表達，是因為GAL4具有能夠特異結合UAS的DNA結合域及轉錄激活域。因此對GAL4蛋白的優化改造，主要是針對GAL4因子含有的這兩個功能域。Distel 等在斑馬魚中將GAL4蛋白進行了優化，首先將GAL4的DNA結合域與四環素轉錄激活子（tTA）的轉錄激活域融合，其次在5’端融合Kozak序列以增強轉錄和翻譯的效率，在3’端融合兔子的β球蛋白的UTR區以增強mRNA的穩定性，該優化后的GAL4蛋白（KalTA4）在斑馬魚中具有很好的誘導活性和誘導精度，且能夠建立含有KalTA4的穩定遺傳的斑馬魚家系（Distel etal., 2009），UAS對GAL4/UAS系統誘導效率影響研究，主要集中在UAS拷貝數多少對其誘導效率的研究上。UAS發生甲基化對GAL4/UAS系統誘導效率影響在不同物種中被發現，已經成為共識（Halpern et al., 2008）。UAS序列之所以會發生甲基化，是因為UAS序列是一種重復序列，且中間含有容易發生甲基化的CpG位點，重復序列的CpG位點常常會發生甲基化修飾，而UAS序列甲基化后將嚴重影響GAL4/UAS系統的誘導表達效率。本發明針對UAS容易發生甲基化影響UAS下游基因的表達的現狀，設計一種全新的非重復UAS序列，很大程度生減輕了甲基化癥狀。

發明內容

針對上述現有技術存在的不足，本發明的目的是提供一種不易被甲基化的改良型UAS序列，以保證GAL4/UAS系統的誘導表達效率，從而促進GAL4/UAS系統在魚類中的應用。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案之一是：一種改良酵母上游激活元件，其特征在于，該上游激活元件為非重復序列。

優選地，上述改良酵母上游激活元件是由UAS-1、間隔序列、UAS-2、間隔序列、UAS-3、間隔序列、UAS-4、間隔序列、UAS-5、間隔序列、啟動子依次組成的非重復序列，其中UAS-1、UAS-2、UAS-3、UAS-4、UAS-5的堿基序列均不相同。

優選地，上述改良酵母上游激活元件的多個間隔序列的長度不一致。