[發(fā)明專利]一種胰島素原前體蛋白的檢測方法及其PPI單克隆抗體的制備方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010586569.6
• 申請日: 2020-06-24
• 公開（公告）號: CN111690064A
• 公開（公告）日: 2020-09-22
• 發(fā)明（設計）人: 朱珠;張小倩;亓振國;方美姑;王長鳳;趙雨;周偉;路江杰;熊愛軍
• 申請（專利權）人: 合肥天麥生物科技發(fā)展有限公司
• 主分類號: C07K16/26
• 分類號: C07K16/26;C12N5/20;G01N33/74;G01N33/577;G01N33/543;G01N33/535
• 代理公司: 蘇州翔遠專利代理事務所(普通合伙) 32251
• 代理人: 王華

一種胰島素原前體蛋白的檢測方法及其PPI單克隆抗體的制備方法，本發(fā)明制備抗胰島素原前體蛋白（PPI）抗體，在此基礎上建立雙抗體夾心ELISA，為重組人胰島素中PPI的檢測方法的確立奠定基礎。本發(fā)明可用于重組人胰島素生產的過程控制和產品放行控制。

技術領域

本發(fā)明屬于重組人胰島素中的胰島素原前體蛋白的檢測技術領域，涉及一種胰島素原前體蛋白的檢測方法及其PPI單克隆抗體的制備方法，特別涉及一種雙抗夾心ELISA的建立方法及其PPI單克隆抗體的制備方法。

背景技術

胰島素參與調節(jié)糖代謝，控制血糖平衡是臨床上用于治療糖尿病的主要藥物。現在臨床常用的胰島素多是采用重組DNA技術將含胰島素DNA的質粒植入大腸桿菌或酵母菌中大量表達形成非活性的胰島素原前體蛋白(Pre-proinsulin，PPI)，再經酶切、純化，得到高純度胰島素。PPI的高效、穩(wěn)定表達是獲得高產率胰島素的前提條件，但未被酶切、去除的PPI會嚴重影響胰島素的質量安全。因此對PPI表達量進行測定，并對酶切、純化過程中以及胰島素中PPI殘留量進行檢測和控制具有非常重要的意義。

歐洲藥典明確指出要對胰島素中PPI進行檢測和控制，但未對檢測方法做出具體要求。目前，常用的方法主要有放射性免疫分析法、高效液相色譜法等。放射性免疫分析法因價格昂貴、容易造成環(huán)境污染、危害人體健康等不足逐漸被淘汰。高效液相色譜法方便、準確，常用來對純化過程中PPI含量進行檢測，但靈敏度較差，無法滿足終產品中PPI殘留檢測的要求。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于提供一種胰島素原前體蛋白的檢測方法及其PPI單克隆抗體的制備方法。

為實現上述目的及其他相關目的，本發(fā)明提供的技術方案是：一種PPI單克隆抗體的制備方法，包括：用胰島素原前體蛋白作為免疫原免疫6-8周齡Balb/c小鼠；初次免疫劑量為100μg/只，與等體積的弗氏完全佐劑混合乳化后免疫小鼠，之后每隔2周免疫一次，第3次免疫兩周后，檢測血清抗體效價，選效價高的小鼠于細胞融合前3天經腹腔注射免疫原胰島素原前體蛋白100μg/只加強免疫；之后眼球取血處死，分離免疫脾細胞；將免疫脾細胞和已經制備好的小鼠骨髓瘤細胞SP2/0進行融合；ELISA篩選陽性單克隆雜交瘤細胞，經3次亞克隆及ELISA檢測完全陽性后，擴大培養(yǎng)并建株；將篩選出的穩(wěn)定分泌目標抗體的雜交瘤細胞以1～5×10⁶個/只的數量接種于已經腹腔注射弗氏不完全佐劑6～8周齡的Balb/c小鼠，待小鼠腹部明顯膨大，以手觸摸時皮膚有緊張感時，用10ml針頭采集腹水；將腹水離心，收集上清，用Protein G凝膠柱進行純化，得到純化后的PPI單克隆抗體。

為實現上述目的及其他相關目的，本發(fā)明提供的技術方案是：一種雙抗夾心ELISA的建立方法，包括將制得的純化后的PPI單克隆抗體用pH值為7.4的PBS緩沖液稀釋至1ug/ml，100ul/孔包被于酶標板中，每孔分別添加150ul的質量分數為2％的BSA溶液，37℃封閉60min，PBST洗滌3次；于檢測孔加100ul的濃度為1ug/ml的胰島素原前體蛋白水溶液，以質量濃度為1％的BSA溶液作為空白對照，37℃放置60min，PBST洗滌3次；按棋盤法排布，檢測孔和空白對照分別加生物素標記的PPI單克隆抗體，100ul/孔，37℃放置60min，PBST洗滌3次；檢測孔和空白對照分別加鏈霉親和素，100ul/孔，37℃放置60min，PBST洗滌3次，檢測孔和空白對照分別加TMB顯色液避光5min，檢測孔和空白對照分別加終止液，用酶標儀讀取450nm波長處的吸光值，以檢測孔吸光值大于2.1倍空白對照孔吸光值作為陽性檢出孔；