[發明專利]一種胰島素原前體蛋白的檢測方法及其PPI單克隆抗體的制備方法

在審

• 申請號: 202010586569.6
• 申請日: 2020-06-24
• 公開（公告）號: CN111690064A
• 公開（公告）日: 2020-09-22
• 發明（設計）人: 朱珠;張小倩;亓振國;方美姑;王長鳳;趙雨;周偉;路江杰;熊愛軍
• 申請（專利權）人: 合肥天麥生物科技發展有限公司
• 主分類號: C07K16/26
• 分類號: C07K16/26;C12N5/20;G01N33/74;G01N33/577;G01N33/543;G01N33/535
• 代理公司: 蘇州翔遠專利代理事務所(普通合伙) 32251
• 代理人: 王華

1.一種PPI單克隆抗體的制備方法，其特征在于：包括：用胰島素原前體蛋白作為免疫原免疫6-8周齡Balb/c小鼠；初次免疫劑量為100μg/只，與等體積的弗氏完全佐劑混合乳化后免疫小鼠，之后每隔2周免疫一次，第3次免疫兩周后，檢測血清抗體效價，選效價高的小鼠于細胞融合前3 天經腹腔注射免疫原胰島素原前體蛋白100μg/只加強免疫；之后眼球取血處死，分離免疫脾細胞；將免疫脾細胞和已經制備好的小鼠骨髓瘤細胞SP2/0進行融合；ELISA篩選陽性單克隆雜交瘤細胞，經3次亞克隆及ELISA檢測完全陽性后，擴大培養并建株；將篩選出的穩定分泌目標抗體的雜交瘤細胞以1～5×10⁶個/只的數量接種于已經腹腔注射弗氏不完全佐劑6～8周齡的Balb/c小鼠，待小鼠腹部明顯膨大，以手觸摸時皮膚有緊張感時，用10ml針頭采集腹水；將腹水離心，收集上清，用Protein G 凝膠柱進行純化，得到純化后的PPI單克隆抗體。

2.一種胰島素原前體蛋白的檢測方法，其特征在于：包括將權利要求1制得的純化后的PPI單克隆抗體用pH值為7.4的PBS緩沖液稀釋至1ug/ml，100ul/孔包被于酶標板中，每孔分別添加150ul的質量分數為2%的BSA溶液，37℃封閉60min，PBST洗滌3次；于檢測孔加100ul的濃度為1ug/ml的胰島素原前體蛋白水溶液，以質量濃度為1%的BSA溶液作為空白對照，37℃放置60min，PBST洗滌3次；按棋盤法排布，檢測孔和空白對照分別加生物素標記的PPI單克隆抗體，100ul/孔，37℃放置60min，PBST洗滌3次；檢測孔和空白對照分別加鏈霉親和素，100ul/孔，37℃放置60min，PBST洗滌3次，檢測孔和空白對照分別加TMB顯色液避光5min，檢測孔和空白對照分別加終止液，用酶標儀讀取450nm波長處的吸光值，以檢測孔吸光值大于2.1倍空白對照孔吸光值作為陽性檢出孔；

步驟2：陽性檢出孔所對應的包被PPI單克隆抗體和生物素標記的PPI單克隆抗體分別作為最佳固相抗體和檢測抗體，將確定的最佳固相抗體包被于酶標板中，加入100 μL系列濃度的胰島素原前體蛋白：82.5pg/mL、41.25pg/mL、20.65pg/mL、10.31pg/mL、5.16pg/mL、2.58pg/mL、1.29pg/mL、0.645pg/mL、0pg/mL，37℃放置60min，PBST洗滌3次；再加入1ug/ml，100ul/孔最佳檢測抗體，進行雙抗夾心ELISA 的操作，每個PPI濃度3 復孔；以各濃度平均OD₄₅₀為縱坐標，以PPI濃度為橫坐標，用SkanIt RE進行標準曲線的擬合，確定檢測的線性范圍和定量方程。

3.根據權利要求2所述的胰島素原前體蛋白的檢測方法，其特征在于：將權利要求1制得的純化后的PPI單克隆抗體用pH值為7.4的濃度為0.1M的PBS緩沖液稀釋到濃度為1mg/mL，超濾去除干擾物質，加入水溶性生物素，室溫反應1小時，超濾去除游離生物素，得到生物素標記的PPI單克隆抗體。