[發明專利]一種固相時間分辨熒光免疫標記物及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 202010585200.3
• 申請日: 2020-06-23
• 公開（公告）號: CN111721931A
• 公開（公告）日: 2020-09-29
• 發明（設計）人: 李奕輝;孔令晨;黃嶺芳
• 申請（專利權）人: 廣州萬孚生物技術股份有限公司
• 主分類號: G01N33/533
• 分類號: G01N33/533;G01N33/543;G01N21/64
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟

1.一種固相時間分辨熒光免疫標記物，其特征在于，所述固相時間分辨熒光免疫標記物包括蛋白質標記的β-二酮體類螯合劑、稀土金屬離子和生物特異性結合反應物。

2.如權利要求1所述的固相時間分辨熒光免疫標記物，其特征在于，所述蛋白質標記的β-二酮體類螯合劑與稀土金屬離子通過螯合作用結合，所述和β-二酮體類螯合劑標記的蛋白質與生物特異性結合反應物通過交聯作用結合。

3.如權利要求1或2所述的固相時間分辨熒光免疫標記物，其特征在于，所述蛋白質包括酪蛋白、小牛血清蛋白、堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、β-半乳糖苷酶或蘋果脫酸氫酶；

優選地，所述β-二酮體類螯合劑包括BCOT、BCDOT、BHHCT、BTBCT或BCTOT；

優選地，所述稀土金屬離子為三價稀土金屬離子；

優選地，所述生物特異性結合反應物包括抗體、抗原、半抗原或鏈霉親和素。

4.如權利要求1-3中任一項所述的固相時間分辨熒光免疫標記物，其特征在于，所述蛋白質與β-二酮體類螯合劑的摩爾比為1:10-1:300，優選1:30-1:150；

優選地，所述β-二酮體類螯合劑上的標記蛋白質與生物特異性結合反應物的摩爾比為1:10-10:1；

優選地，所述β-二酮體類螯合劑與稀土金屬離子的摩爾比為1:10-10:1。

5.如權利要求1-4中任一項所述的固相時間分辨熒光免疫標記物的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括如下步驟：

(1)將蛋白質與β-二酮體類螯合劑混合反應，得到結合物A；

(2)使用交聯劑a活化結合物A，得到待結合物A；使用交聯劑b活化生物特異性結合反應物，得到待結合物B；

(3)將待結合物A和待結合物B進行交聯反應，得到交聯物C；

(4)將交聯物C與稀土金屬鹽混合，得到所述固相時間分辨熒光免疫標記物。

6.如權利要求5所述的固相時間分辨熒光免疫標記物的制備方法，其特征在于，步驟(1)所述蛋白質與β-二酮體類螯合劑的摩爾比為1:10-1:300，優選1:30-1:150；

優選地，步驟(1)所述混合前將蛋白質溶解于緩沖液中，濃度為0.02-1％；

優選地，所述緩沖液包括碳酸緩沖液，濃度為0.01-0.5M，pH值為9-11；

優選地，步驟(1)所述混合前將β-二酮體類螯合劑溶解于有機溶劑中，濃度為0.02-1％；

優選地，所述溶劑包括無水乙醇、無水甲醇、二甲基亞砜、二甲基甲酰胺或苯乙烯中的任意一種或至少兩種的組合；

優選地，步驟(1)所述反應的溫度為4-50℃，時間為0.5-2h。

7.如權利要求5或6所述的固相時間分辨熒光免疫標記物的制備方法，其特征在于，步驟(2)所述交聯劑a包括羥基琥珀酰亞胺交聯劑；

優選地，所述羥基琥珀酰亞胺交聯劑包括3-馬來酰亞胺基苯甲酸琥珀酰亞胺酯、琥珀酸辛二酸戊二酸鹽、琥珀酸辛二酸二亞胺或琥珀酰亞胺4-[P-苯基馬來酰亞胺]-丁酸；

優選地，步驟(2)所述結合物A與交聯劑a的摩爾比為1:(50-5000)，優選1:(50-500)；

優選地，步驟(2)所述交聯劑a活化結合物A的溫度為4-37℃，時間為0.5-2h；

優選地，步驟(2)所述交聯劑b包括巰基交聯劑；

優選地，所述巰基交聯劑包括二硫蘇糖醇、三(2-羧乙基)膦或乙醇胺；

優選地，步驟(2)所述生物特異性結合反應物與交聯劑b的摩爾比為1:(50-5000)，優選1:(50-500)；

優選地，步驟(2)所述交聯劑b活化生物特異性結合反應物的溫度為4-37℃，時間為0.5-2h。