[發(fā)明專利]一種固相時間分辨熒光免疫標記物及其制備方法和應用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010585200.3
• 申請日: 2020-06-23
• 公開（公告）號: CN111721931A
• 公開（公告）日: 2020-09-29
• 發(fā)明（設計）人: 李奕輝;孔令晨;黃嶺芳
• 申請（專利權(quán)）人: 廣州萬孚生物技術(shù)股份有限公司
• 主分類號: G01N33/533
• 分類號: G01N33/533;G01N33/543;G01N21/64
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟

本發(fā)明提供一種固相時間分辨熒光免疫標記物及其制備方法和應用，所述固相時間分辨熒光免疫標記物包括蛋白質(zhì)標記的β?二酮體類螯合劑、稀土金屬離子和生物特異性結(jié)合反應物。該固相時間分辨熒光免疫標記物無需加入增強液或生物素?親和素體系進行信號放大，即可直接參與免疫反應并可直接用于檢測，操作簡單，用時短，具有可重復性，克服了現(xiàn)有技術(shù)中時間分辨分析法需添加增強液導致污染、操作繁瑣、反應時間長、且標記物生產(chǎn)一致性差的問題。且該標記物可于4℃下保存，或通過凍干工藝，制成粉狀，于常溫干燥條件下穩(wěn)定保存。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于體外診斷技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種固相時間分辨熒光免疫標記物及其制備方法和應用，尤其涉及一種靈敏度高、準確度高、生產(chǎn)一致性好、操作簡便、風險小的固相時間分辨熒光免疫標記物及其制備方法和應用。

背景技術(shù)

時間分辨熒光免疫分析(Time-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA)技術(shù)是一種新型的以鑭系稀土元素絡合物作為標記物，測量其發(fā)射熒光強度的體外超微量分析技術(shù)。由于時間分辨熒光免疫分析法相對于其他放射免疫分析法來說，具有更高的靈敏度和準確度，近年來該技術(shù)在臨床檢測、生命科學、醫(yī)學等研究領(lǐng)域中的應用越來越廣泛，已成為一種極具發(fā)展前景的分析手段。

TRFIA利用具有獨特熒光特性的三價稀土元素離子及其絡合物作為示蹤物，得益于稀土絡合物熒光壽命長、激發(fā)光譜帶寬、發(fā)射光譜窄及Stokes位移大等熒光特性。稀土元素作為金屬離子，不能直接與抗原抗體結(jié)合，因此在標記過程中需使用具有雙功能基團的絡合配體，實現(xiàn)與稀土元素離子形成配位，同時在不影響熒光強度的前提下與生物分子共價結(jié)合。TRFIA技術(shù)在30多年的演化和發(fā)展過程中，國內(nèi)外學者對熒光稀土絡合配體進行了大量研究，如多氨基多羧基類絡合物、芳香羧酸類絡合物及β-二酮體類絡合物等。

CN105911041A公開了一種時間分辨熒光檢測方法，把特異反應體系的一株生物原料包被在磁珠上，將包被生物原料的磁珠與被測樣本反應，清洗后加入另一株已標記β-二酮類稀土配合物的特異性生物原料，發(fā)生免疫反應，使磁珠、被測樣本和熒光示蹤物形成復合物，清洗后再加入熒光增強物，最后用時間分辨熒光儀檢測，獲得被測樣本的濃度等信息。

CN106053783A公開了一種適用于結(jié)核感染T細胞檢測的快速時間分辨熒光免疫分析試劑盒，本發(fā)明的試劑盒采用了γ-干擾素體外釋放法，聯(lián)合采用了生物素親和素法，雙抗體夾心時間分辨熒光免疫法，實驗方法簡單快速，可自動化操作，檢測系統(tǒng)為開放式操作系統(tǒng)。

目前TRFIA可分為均相分析法和固相分析法，前者需要使稀土金屬離子從絡合物中解離下來，與增強液中的增效劑形成新的可產(chǎn)生熒光的絡合物，用于儀器測量。但是由于增強液中存在過量的β-NTA，使其極其容易被環(huán)境中的稀土金屬離子污染，造成背景信號的升高，操作及保存都需非常小心。后者應用FIAgen系統(tǒng)，利用4,7-二氯磺基苯-1,10-二氮雜菲-2,9-二羧酸螯合劑(BCPDA)螯合稀土金屬離子經(jīng)紫外光激發(fā)，發(fā)出熒光信號。該體系在生物素-親和素體系信號放大的基礎上，有效彌補了BCPDA檢測靈敏度的不足(10-11mol/L)。但該體系需進行兩步或多步反應，反應過程長，且試劑組成復雜。后者還可直接使用生物特異性結(jié)合反應物與β-二酮體類螯合劑結(jié)合的標記物，但該種標記物一致性較差，靈敏度差，僅可在-20℃保存，使用過程繁瑣。

因此，開發(fā)一種操作簡便，靈敏度高且風險小的固相標記物是非常有意義的。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種固相時間分辨熒光免疫標記物及其制備方法和應用，尤其提供一種靈敏度高、準確度高、生產(chǎn)一致性好、操作簡便、風險小的固相時間分辨熒光免疫標記物及其制備方法和應用。

為達到此發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

第一方面，本發(fā)明提供一種固相時間分辨熒光免疫標記物，所述固相時間分辨熒光免疫標記物包括蛋白質(zhì)標記的β-二酮體類螯合劑、稀土金屬離子和生物特異性結(jié)合反應物。