[發明專利]一種耐冬山茶葉片總RNA提取方法

在審

• 申請號: 202010582864.4
• 申請日: 2020-06-23
• 公開（公告）號: CN111647595A
• 公開（公告）日: 2020-09-11
• 發明（設計）人: 孫迎坤;范夢龍;解豐羽
• 申請（專利權）人: 青島農業大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 北京匯捷知識產權代理事務所(普通合伙) 11531
• 代理人: 馬金華

本發明的目的在于提供一種耐冬山茶葉片總RNA提取方法，從耐冬山茶植株上剪取革質化后的嫩葉，在盛有液氮的研缽中加入等體積交聯聚乙烯基吡咯烷酮和樣本粉末研磨，抽取裂解液上清加入等體積的TRIZOL試劑，加入五分之一體積氯仿，混勻乳化呈乳白色，靜置，離心；抽取上清液至新的RNase?free tube中，加入等體積的乙醇，迅速混勻；將混合液加入RNA吸附柱，離心，倒掉收集管中的廢液；加入乙醇，離心，倒掉廢液；將RNA吸附柱置于一個離心管中，加入RNAfree?H₂O，室溫靜置，離心。本發明的有益效果是提取的總RNA可用于pacbio平臺進行全長轉錄組測序或全轉錄組測序分析。同時，該技術成本較試劑盒低廉。

技術領域

本發明屬于RNA基因提取技術領域，涉及一種耐冬山茶葉片總RNA提取方法。

背景技術

目前植物總RNA提取一般采取試劑盒方法。試劑盒成本較高，且存在濃度低、完整性差等問題，例如takara和天根多糖多酚型試劑盒提取的RNA濃度較低、完整性較差、bioflux試劑盒提取的RNA降解嚴重等。常規TRIZOL法無法提取多糖類組織，CTAB無法提取多酚類組織、SDS等傳統手提方法均不能有效獲得高質量耐冬山茶葉片RNA。

發明內容

本發明的目的在于提供一種耐冬山茶葉片總RNA提取方法，本發明的有益效果是提取的總RNA可用于pacbio平臺進行全長轉錄組測序或全轉錄組測序分析。同時，該技術成本較試劑盒低廉。

本發明所采用的技術方案按照以下步驟進行：

1、從耐冬山茶植株上剪取革質化后的嫩葉，用錫紙包裹放入液氮中速凍，備用。在研缽中加入等體積交聯聚乙烯基吡咯烷酮，邊加液氮邊快速研磨，盡快使耐冬山茶葉片成粉末狀；

2、取葉片粉末加入裂解液試劑，震蕩機上混勻至無明顯大顆粒物狀態，靜置裂解，低溫離心；

3、裂解液上清加入等體積的TRIZOL試劑，室溫靜置；

4、加入五分之一體積氯仿，混勻乳化呈乳白色，靜置，離心；

5、抽取上清液至新的RNase-free tube中，加入等體積的乙醇，迅速混勻；將混合液加入RNA吸附柱，離心，倒掉收集管中的廢液；

6、加入乙醇，離心，倒掉廢液；

7、將RNA吸附柱置于一個離心管中，加入RNAfree-H2O，室溫靜置，離心。

具體實施方式

下面結合具體實施方式對本發明進行詳細說明。

1、10s內從耐冬山茶植株上剪取革質化后的嫩葉，用錫紙包裹放入液氮中速凍1h以上，備用。在研缽中加入等體積交聯聚乙烯基吡咯烷酮(pvpp)，邊加液氮邊快速研磨，盡快使耐冬山茶葉片成粉末狀；

2、取50-100mg葉片粉末加入裂解液Fruit-mate^TM for RNA purification(takara)試劑，震蕩機上混勻至無明顯大顆粒物狀態，4℃靜置裂解5min，12000xg 4℃低溫離心5-10min(視裂解程度適當延長)；

3、裂解液上清加入等體積的TRIZOL試劑，室溫靜置5-10min(視裂解程度可適當延長)；

4、加入五分之一體積(200ul)氯仿，混勻乳化呈乳白色，靜置5min，12000xg 4℃離心15min；

5、抽取上清液(切勿吸到中間層DNA及下層蛋白質)至新的1.5ml的RNase-freetube中，加入等體積的75％乙醇，迅速混勻；將混合液加入RNA吸附柱(市面售賣的均可)，12000xg離心30s，倒掉收集管中的廢液(混合液較多時，可分兩次加入)；