[發(fā)明專利]一種基于催化發(fā)夾組裝-動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)的端粒酶活性檢測方法

有效

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• 申請日: 2020-06-23
• 公開（公告）號: CN111693415B
• 公開（公告）日: 2022-11-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄒李
• 申請（專利權(quán)）人: 廣東藥科大學(xué)
• 主分類號: G01N15/02
• 分類號: G01N15/02
• 代理公司: 廣州科沃園專利代理有限公司 44416
• 代理人: 黃健儀

本發(fā)明公開了一種基于催化發(fā)夾組裝?動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)的端粒酶活性檢測方法，包括如下步驟：提取待測樣品中的端粒酶，催化發(fā)夾組裝產(chǎn)物獲得和動(dòng)態(tài)光散射檢測得到信號，實(shí)現(xiàn)對端粒酶活性的高靈敏檢測。本發(fā)明提供的端粒酶活性檢測方法操作簡單，成本低，所需樣品少且特異性好，利用該方法能夠檢測多種癌癥患者尿液中的端粒酶活性，尤其在膀胱癌的無創(chuàng)診斷方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于催化發(fā)夾組裝-動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)的端粒酶活性檢測方法。

背景技術(shù)

端粒是真核生物染色體末端的一種特殊結(jié)構(gòu)，能夠防止染色體DNA的降解、末端融合、非正常重組等。在正常體細(xì)胞中，端粒長度隨著細(xì)胞的周期分裂遞減，最終導(dǎo)致細(xì)胞無法繼續(xù)分裂，使細(xì)胞壽命受到限制，防止細(xì)胞過度分裂。端粒酶是一種核糖核蛋白酶，能以自身RNA為模板，在染色體末端延伸TTAGGG重復(fù)序列以維持端粒長度。研究表明，端粒酶活性在大多數(shù)正常體細(xì)胞中被抑制，但在85-90％的腫瘤細(xì)胞中被高度激活，如乳腺癌、肝癌、肺癌、胃癌等。因此，端粒酶被認(rèn)為是癌癥早期診斷的潛在生物標(biāo)志物，端粒酶活性的有效檢測對生物醫(yī)學(xué)研究具有重要的意義。

目前，基于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的端粒重復(fù)序列擴(kuò)增法(TRAP)是檢測端粒酶活性的常用方法。然而，該方法存在操作復(fù)雜，費(fèi)用昂貴以及易受諸多因素的干擾而產(chǎn)生假陽性結(jié)果等問題。近年來，人們又開發(fā)了一些無需PCR反應(yīng)的端粒酶活性檢測方法，例如等溫核酸擴(kuò)增法，比色法、熒光分析法、電化學(xué)分析法和化學(xué)發(fā)光法等。盡管這些方法可以避免PCR反應(yīng)的缺點(diǎn)，但也存在一些不足，如程序復(fù)雜、靈敏度低和特異性差等。因此，開發(fā)一種靈敏度高、選擇性好、可操作性強(qiáng)的端粒酶活性檢測方法是癌癥早期診斷中急需解決的問題。

催化發(fā)夾組裝(catalytic hairpin assembly，CHA)，作為一種新型的無酶級聯(lián)擴(kuò)增策略備受關(guān)注。其原理主要是在目標(biāo)物的作用下，引發(fā)鏈誘導(dǎo)發(fā)夾探針進(jìn)行組裝，然后被置換出來引發(fā)下一輪反應(yīng)，起到類似催化劑的作用，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物檢測信號的放大。動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)(Dynamic Light Scattering，DLS)是一種常用光學(xué)測量技術(shù)，可以用來測定直徑在0.5nm～6μm之間顆粒大小，由于它的高靈敏度，已成為一種重要的分析工具。DLS技術(shù)被廣泛應(yīng)用于疾病相關(guān)的生物分子和金屬離子的檢測。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種基于催化發(fā)夾組裝-動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)的端粒酶活性檢測方法，通過測定催化發(fā)夾組裝產(chǎn)物的動(dòng)態(tài)光散射信號，實(shí)現(xiàn)對端粒酶活性的高靈敏檢測，具有靈敏度高、選擇性好、特異性好和可操作性強(qiáng)的有益效果，能夠有效檢測待測樣品中端粒酶的活性。

本發(fā)明的上述發(fā)明目的是通過以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的：

一種基于催化發(fā)夾組裝-動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)的端粒酶活性檢測方法，包括以下步驟：

S1、端粒酶提取：利用CHAPS法提取待測樣品中的端粒酶，得到待測端粒酶提取物；

S2、催化發(fā)夾組裝產(chǎn)物獲得：將待測端粒酶提取物與端粒酶引物在延伸反應(yīng)緩沖液進(jìn)行延伸反應(yīng)，得到延伸產(chǎn)物，然后在延伸產(chǎn)物加入金納米粒子探針，在溫度為25-40℃進(jìn)行催化發(fā)夾組裝反應(yīng)，得到催化發(fā)夾組裝產(chǎn)物；

S3、動(dòng)態(tài)光散射檢測：催化發(fā)夾組裝產(chǎn)物通過動(dòng)態(tài)光散射測量粒徑大小得到動(dòng)態(tài)光散射信號。

優(yōu)選的，所述步驟S2中的端粒酶引物序列為：5`-AAT CCG TCG AGC AGA GTT-3`；所述延伸產(chǎn)物序列為：5`-AAT CCG TCG AGC AGA GTT AGGG TTA GGG-3`。

優(yōu)選的，所述步驟S2中的金納米粒子探針混合物包括發(fā)夾探針H1修飾的金納米粒子(AuNPs-H1探針)和發(fā)夾探針H2修飾的金納米粒子(AuNPs-H2探針)。