[發明專利]一種基于催化發夾組裝-動態光散射技術的端粒酶活性檢測方法有效
| 申請號： | 202010580953.5 | 申請日： | 2020-06-23 |
| 公開（公告）號： | CN111693415B | 公開（公告）日： | 2022-11-29 |
| 發明（設計）人： | 鄒李 | 申請（專利權）人： | 廣東藥科大學 |
| 主分類號： | G01N15/02 | 分類號： | G01N15/02 |
| 代理公司： | 廣州科沃園專利代理有限公司 44416 | 代理人： | 黃健儀 |
| 地址： | 510006 廣東*** | 國省代碼： | 廣東;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 基于 催化 發夾 組裝 動態 散射 技術 端粒 活性 檢測 方法 | ||
1.一種非疾病診斷目的的基于催化發夾組裝-動態光散射技術的端粒酶活性檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：
S1、端粒酶提取：利用CHAPS法提取待測樣品中的端粒酶，得到待測端粒酶提取物；
S2、催化發夾組裝產物獲得：將待測端粒酶提取物與端粒酶引物在延伸反應緩沖液中進行延伸反應，得到延伸產物，然后在延伸產物中加入摩爾濃度為2-6nM的金納米粒子探針，在溫度為25-40℃進行催化發夾組裝反應，得到催化發夾組裝產物；
S3、動態光散射檢測：催化發夾組裝產物通過動態光散射檢測得到信號；
所述步驟S2中的金納米粒子探針包括發夾探針H1修飾的金納米粒子AuNPs-H1探針和發夾探針H2修飾的金納米粒子AuNPs-H2探針；
所述發夾探針H1的序列為5`-SH-(CH2)6-CCC TAA CCC TAA CTC TGC CTA GGG TAC TGCAGA GTT AGGG-3`；所述發夾探針H2的序列為5`-SH-(CH2)6-CTC TGC AGT ACC CTA GGC AGAGTT AGG GTA CTG-3`。
2.根據權利要求1所述的非疾病診斷目的的基于催化發夾組裝-動態光散射技術的端粒酶活性檢測方法，其特征在于，所述步驟S2中的端粒酶引物序列為：5`-AAT CCG TCG AGCAGA GTT-3`；所述延伸產物序列為：5`-AAT CCG TCG AGC AGA GTT AGGG TTA GGG-3`。
3.根據權利要求1所述的非疾病診斷目的的基于催化發夾組裝-動態光散射技術的端粒酶活性檢測方法，其特征在于，所述步驟S2中的金納米粒子探針的制備方法包括以下步驟：
A、分別在發夾探針H1和發夾探針H2中添加磷酸三（2-氯乙基）酯，置于25-30℃下處理0.5-3 h后得到產物H1`、H2`，分別加入金納米粒子溶液并室溫孵育12-18h得到產物AuNPs-H1`和AuNPs-H2`；
B、在上述產物AuNPs-H1`和AuNPs-H2`中分別加入終濃度為0.1 M的氯化鈉溶液，進行鹽老化處理25-50 h后，在4℃條件下以13800 rpm的轉速離心15-30分鐘，棄上清后，加入PBS緩沖液洗滌2-4次得到油狀沉淀物，分別加入PBS緩沖液，pH = 7.0-7.4，0.1M NaCl溶解即得金納米粒子探針AuNPs-H1和AuNPs-H2。
4.根據權利要求3所述的非疾病診斷目的的基于催化發夾組裝-動態光散射技術的端粒酶活性檢測方法，其特征在于，所述步驟A中產物H1`、H2`與金納米粒子的摩爾比為100-200:1。
5.根據權利要求1所述的非疾病診斷目的的基于催化發夾組裝-動態光散射技術的端粒酶活性檢測方法，其特征在于，所述步驟S2中延伸反應的溫度為25-40℃，反應時間為0.5-3h。
6.根據權利要求1所述的非疾病診斷目的的基于催化發夾組裝-動態光散射技術的端粒酶活性檢測方法，其特征在于，所述步驟S3中的動態光散射檢測的溫度為25-30℃，散射角為90-120°，紅色激光波長為610-650nm，激光功率為3-6mW。
7.根據權利要求1所述的非疾病診斷目的的基于催化發夾組裝-動態光散射技術的端粒酶活性檢測方法，其特征在于，所述待測樣品選自膀胱癌細胞，人乳腺癌細胞或人宮頸癌細胞，所述膀胱癌細胞，人乳腺癌細胞或人宮頸癌細胞的細胞濃度的檢測下限是3個細胞/μL。
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