[發(fā)明專利]一種基因編輯轉(zhuǎn)基因作物編輯位點特異性PCR方法及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010580385.9
• 申請日: 2020-06-23
• 公開（公告）號: CN111793707B
• 公開（公告）日: 2022-04-22
• 發(fā)明（設計）人: 武玉花;張洪文;李俊;趙圣博;閆曉紅;高鴻飛;李允靜;吳剛
• 申請（專利權）人: 中國農(nóng)業(yè)科學院油料作物研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12Q1/6851
• 代理公司: 北京市誠輝律師事務所 11430
• 代理人: 范盈

本發(fā)明公開一種基因編輯轉(zhuǎn)基因作物編輯位點特異性PCR方法及其應用，具體公開了檢測方法包括如下步驟。1)收集序列：收集靶標基因野生型核苷酸序列和基因編輯作物中基因編輯核苷酸序列；(2)設計引物/探針：根據(jù)上述核苷酸序列，在編輯序列的兩側設計野生型基因和編輯基因的通用引物對；(3)PCR擴增：以基因編輯作物的基因組DNA為模板，利用引物探針組合進行PCR擴增檢測。本發(fā)明利用通用引物和編輯位點特異性TaqMan探針，能特異性識別并準確定量基因編輯作物，適用于基因編輯作物的身份鑒定和定量檢測。

技術領域

本發(fā)明涉及生物技術領域中DNA檢測方法，尤其涉及一種針對基因編輯轉(zhuǎn)基因作物的編輯位點特異性TaqMan探針PCR方法，用于基因編輯轉(zhuǎn)基因作物的編輯位點特異性定性定量檢測。

背景技術

基因編輯技術作為近年來興起的一種新的育種技術，能夠?qū)χ参锘蚪M進行高效、精準、特異的修飾，在植物領域廣泛應用。如杜邦先鋒·公司利用基因編輯技術敲除Wx1基因培育的糯玉米、陶氏益農(nóng)公司運用ZFN技術培育成的一種基因組編輯玉米、抗除草劑轉(zhuǎn)基因油菜、抗褐變蘑菇、利用CRISPR/Cas9技術編輯ARGOS8啟動子區(qū)獲得的抗旱高產(chǎn)的基因編輯玉米等。

基因組編輯技術可以對基因組進行插入、突變等修飾操作，從而獲得不同類型的基因組編輯轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品。目前在國際上基因組編輯技術對基因組進行修飾的種類主要分為3類：(1)SDN1類型，不涉及修復模板，不引入任何外源基因，只包括點突變、少量幾個堿基插入或缺失；(2)SDN2類型，通過同源重組途徑進行修復，導致基因1個到幾個堿基突變(20bp)；(3)SDN3類型,含有長度達到數(shù)kb的外源DNA。由于SDN3類轉(zhuǎn)基因作物含有較長的外源DNA片段，可以采用傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)化體特異性PCR方法對該類基因編輯轉(zhuǎn)基因作物進行特異性識別和定量檢測。而SDN1和SDN2類基因編輯作物由于直接在生物自身基因組上進行定向編輯，最終基因編輯產(chǎn)品一般在靶標位點僅含有少數(shù)堿基的突變，與傳統(tǒng)采用的自然突變和人工誘變突變體具有高度的相似性。對于不含有外源DNA片段的SDN1和SDN2型基因編輯轉(zhuǎn)基因作物不適宜用傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)化體特異性檢測方法進行身份鑒定和定量檢測。

我國《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評價管理辦法》中規(guī)定，農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物是指利用基因工程技術改變基因組構成，用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)或者農(nóng)產(chǎn)品加工的動植物、微生物及其產(chǎn)品。雖然目前在國外批準商業(yè)化種植和銷售的基因編輯轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品與以前傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因生物相比，其研究者往往聲稱并不含有任何外來基因序列或蛋白序列，但其仍然符合“利用基因工程技術改變基因組構成”特征，屬于農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物。依據(jù)法規(guī)，我國安全管理部門要對研發(fā)中和商業(yè)化的基因編輯轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進行安全監(jiān)管和檢測。針對基因編輯轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測，前期已經(jīng)提出了很多方法，如限制性片段長度多態(tài)性分析(PCR/RE)、CAPS(derivedcleaved amplified polymorphic sequence)衍生方法、限制性酶切PCR法、錯配切割法、臨界退火溫度PCR(ACT-PCR)、高分辨率溶解曲線、Sanger測序法、擴增片段長度多態(tài)性、PCR單鏈構象多態(tài)分析法等。除了測序法，以上這些方法都只能定性檢測轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中的靶標基因是否被編輯，不能識別特異的編輯位點，不能滿足轉(zhuǎn)基因生物安全監(jiān)管中對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進行精準身份識別和準確定量檢測的需求；測序法雖然能通過序列分析可識別特異的編輯位點，但該方法相對耗時費力，且不能滿足轉(zhuǎn)基因生物安全監(jiān)管中對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進行準確定量檢測的需求。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有基因編輯作物檢測方法存在的不足，提供一種基因編輯轉(zhuǎn)基因作物的編輯位點特異性定性定量PCR方法。本發(fā)明通過對基因編輯轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的分子特征進行分析，提供一種能對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進行精準身份識別和準確定量檢測的編輯位點特異性定性定量檢測方法，為基因編輯轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全監(jiān)管和產(chǎn)權保護提供技術支撐。

本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的：