[發(fā)明專利]一種基因編輯轉(zhuǎn)基因作物編輯位點(diǎn)特異性PCR方法及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010580385.9
• 申請日: 2020-06-23
• 公開（公告）號: CN111793707B
• 公開（公告）日: 2022-04-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 武玉花;張洪文;李俊;趙圣博;閆曉紅;高鴻飛;李允靜;吳剛
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12Q1/6851
• 代理公司: 北京市誠輝律師事務(wù)所 11430
• 代理人: 范盈

1.一種適用于基因編輯水稻的編輯位點(diǎn)的PCR檢測方法，其特征在于：包括以下步驟：

(1)收集序列

收集靶標(biāo)基因野生型核苷酸序列和基因編輯水稻中基因編輯核苷酸序列；

(2)設(shè)計(jì)引物/探針

根據(jù)上述核苷酸序列，在編輯序列的兩側(cè)設(shè)計(jì)野生型基因和編輯基因的通用引物和探針；

(3)PCR擴(kuò)增

以基因編輯水稻的基因組DNA為模板，利用引物探針組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測；

其中，步驟(2)設(shè)計(jì)的引物使得擴(kuò)增產(chǎn)物大小小于250bp，且擴(kuò)增產(chǎn)物包含基因編輯位點(diǎn)區(qū)域；步驟(2)設(shè)計(jì)的探針包括野生型探針和基因編輯位點(diǎn)探針，所述基因編輯位點(diǎn)探針能夠結(jié)合包含基因編輯位點(diǎn)的區(qū)域，所述野生型探針包含基因編輯位點(diǎn)的區(qū)域?qū)?yīng)的野生型基因的區(qū)域；所述探針為TaqMan探針；

其中，

步驟(1)中，收集靶標(biāo)基因野生型核苷酸序列和基因編輯水稻中基因編輯核苷酸序列為Cao基因野生型核苷酸序列和Cao基因編輯水稻中基因編輯核苷酸序列；或者為SP1基因野生型核苷酸序列和SP1基因編輯水稻中基因編輯核苷酸序列

步驟(2)中，針對Cao基因編輯檢測設(shè)計(jì)的引物和探針分別為：

Cao基因編輯序列的引物：

CAO-F:CGGTGATGATGGAGCTGACT SEQ ID No：1

CAO-R:GATATCGAACCGGACCACCT SEQ ID No：2

Cao基因野生型和基因編輯序列的探針：

CAO-WP：TGCAATTGGAACCCTTGGCCC SEQ ID No：3

CAO-E1-P:AAGAACTTGCCTTTTCCCCGG SEQ ID No：4

CAO-E2-P：TTGGAACCCTTGGAACCCCG SEQ ID No：5

CAO-E3-P：CCCTTGCCCGGGTCATC SEQ ID No：6

CAO-E4-P：CAATTGGAACCCTTCCCCGG SEQ ID No：7

CAO-E5-P：AGGCCTTGTTCCCATTGCAAA SEQ ID No：8

CAO-E6-P：CCATGTCGATGACGTTCCAATTGC SEQ ID No：9；

針對SP1基因編輯檢測設(shè)計(jì)的引物和探針分別為：

SP1基因編輯序列的引物：

SP-F:CCCAAGAAATAATGGATTAAGAGAG SEQ ID No：10

SP-R:GAGCTTGCGTTGAGTGAG SEQ ID No：11

SP1基因野生型和基因編輯序列的探針：

SP-W-P：ACCACCCTTGGGGCCTTG SEQ ID No：12

SP-E1-P:CAAGGCCCCAAGACACCATG SEQ ID No：13

SP-E2-P：TCGGAGCCATCCTTGCCTTGACT SEQ ID No：14

SP-E3-P：AGGCAAGGCCCCACCAT SEQ ID No：15

SP-E4-P：CAAGGCCCCATGGCTGC SEQ ID No：16；

其中，步驟(3)中擴(kuò)增時(shí)，以多組引物探針組合分別進(jìn)行檢測。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的PCR檢測方法，其特征在于，步驟3)PCR擴(kuò)增檢測為實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增檢測和/或數(shù)字PCR擴(kuò)增檢測。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的PCR檢測方法，所述探針的5’末端攜帶熒光基團(tuán)；3’端攜帶淬滅基團(tuán)。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的PCR檢測方法，其中所述探針的5’末端攜帶熒光基團(tuán)選自FAM、TET、VIC、HEX；3’端攜帶淬滅基團(tuán)選自TAMRA、BHQ。

5.一種基因編輯水稻的檢測試劑盒，其中包括Cao基因編輯檢測設(shè)計(jì)的引物和探針，或包含針對SP1基因編輯檢測設(shè)計(jì)的引物和探針；

其中，試劑盒中包含多組檢測組合物，每組檢測組合物中包含引物以及其中一種探針；

所述的基因編輯水稻為Cao基因編輯水稻或SP1基因編輯水稻；

針對Cao基因編輯檢測設(shè)計(jì)的引物和探針分別為：

Cao基因編輯序列的引物：

CAO-F:CGGTGATGATGGAGCTGACT SEQ ID No：1

CAO-R:GATATCGAACCGGACCACCT SEQ ID No：2

Cao基因野生型和基因編輯序列的探針：

CAO-WP：TGCAATTGGAACCCTTGGCCC SEQ ID No：3

CAO-E1-P:AAGAACTTGCCTTTTCCCCGG SEQ ID No：4

CAO-E2-P：TTGGAACCCTTGGAACCCCG SEQ ID No：5

CAO-E3-P：CCCTTGCCCGGGTCATC SEQ ID No：6

CAO-E4-P：CAATTGGAACCCTTCCCCGG SEQ ID No：7

CAO-E5-P：AGGCCTTGTTCCCATTGCAAA SEQ ID No：8

CAO-E6-P：CCATGTCGATGACGTTCCAATTGC SEQ ID No：9；

針對SP1基因編輯檢測設(shè)計(jì)的引物和探針分別為：

SP1基因編輯序列的引物：

SP-F:CCCAAGAAATAATGGATTAAGAGAG SEQ ID No：10

SP-R:GAGCTTGCGTTGAGTGAG SEQ ID No：11

SP1基因野生型和基因編輯序列的探針：

SP-W-P：ACCACCCTTGGGGCCTTG SEQ ID No：12

SP-E1-P:CAAGGCCCCAAGACACCATG SEQ ID No：13

SP-E2-P：TCGGAGCCATCCTTGCCTTGACT SEQ ID No：14

SP-E3-P：AGGCAAGGCCCCACCAT SEQ ID No：15

SP-E4-P：CAAGGCCCCATGGCTGC SEQ ID No：16。