[發明專利]一種篩選檢測少弱精癥相關蛋白標志物的方法及其應用

在審

• 申請號: 202010580098.8
• 申請日: 2020-06-23
• 公開（公告）號: CN111707748A
• 公開（公告）日: 2020-09-25
• 發明（設計）人: 黃寧;張曼玉;劉曉;孫勝楠;韓超
• 申請（專利權）人: 山東立菲生物產業有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/34;G01N30/36;G01N30/72;G01N30/74;G01N30/88;G01N33/68
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 宋海海

本發明提供一種篩選檢測少弱精癥相關蛋白標志物的方法及其應用，屬于生物醫學和分子診斷技術領域。本發明首先對正常和病人精子蛋白進行提取酶解，然后以牛血清白蛋白(BSA)為標準品利用高分辨生物質譜和非標記定量蛋白質組學方法對多組重度少弱精疾病的精子蛋白進行深度的質譜分析；然后利用蛋白定量分析方法對質譜數據進行搜索，盡可能大量的鑒定出精子中蛋白質；最后通過正常和病人精子蛋白組的比較，得到與重度少弱精癥相關的蛋白，從而將其作為重度少弱精癥的蛋白標志物，篩選檢測方法目標明確，試驗結果準確可靠，因此具有良好的實際應用之價值。

技術領域

本發明屬于生物醫學和分子診斷技術領域，具體涉及一種篩選檢測少弱精癥相關蛋白標志物的方法及其應用。

背景技術

公開該背景技術部分的信息僅僅旨在增加對本發明的總體背景的理解，而不必然被視為承認或以任何形式暗示該信息構成已經成為本領域一般技術人員所公知的現有技術。

不孕不育已成為全世界范圍內的生殖健康問題，其中由于男性因素造成的不育大概占50％左右，且近年來呈上升的趨勢。造成男性不育的主要原因是少精弱精癥。根據世界衛生組織的定義，弱精子癥是指精液中前向運動的精子少于32％。弱精子癥是男性不育的主要原因之一。弱精子癥約占男性不育的19％，而少精弱精或畸形弱精子癥占男性不育的63％。盡管許多因素如生活方式、環境污染、精索靜脈曲張以及感染等可能會導致弱精子癥。但是遺傳因素也是不可忽視的原因。

目前關于精子蛋白質組的研究已有報道。Saraswat等利用UPLC-MS的方法在人類精子中定量了667個蛋白，并且分析出了20個健康人和弱精癥患者精子中的差異蛋白。最新更新的人類精子蛋白質組共6198個蛋白。Gaigai Wang等利用高分辨質譜在人類精子中鑒定出4675個蛋白。蛋白質是生命活動的分子基礎，將疾病狀態下異常的或者數量變化極大的特異蛋白作為疾病的生物標志物進而用于診斷疾病的進程具有重要意義。因此，有必要提供一種簡單易行、高通量的基于蛋白質組學對少弱精癥相關蛋白進行篩選檢測。

發明內容

針對上述現有技術中存在的問題，本發明目的在于提供一種篩選檢測少弱精癥相關蛋白標志物的方法及其應用。本發明首先對正常和病人精子蛋白進行提取酶解，然后以牛血清白蛋白(BSA)為標準品利用高分辨生物質譜和非標記定量蛋白質組學方法對多組重度少弱精疾病的精子蛋白進行深度的質譜分析；然后利用蛋白定量分析方法對質譜數據進行搜索，盡可能大量的鑒定出精子中蛋白質；最后通過正常和病人精子蛋白組的比較，得到與重度少弱精癥相關的蛋白，從而將其作為重度少弱精癥的蛋白標志物，篩選檢測方法目標明確，試驗結果準確可靠，因此具有良好的實際應用之價值。

為了實現上述技術目的，本發明的技術方案為：

本發明的第一個方面，提供一種篩選檢測少弱精癥相關蛋白標志物的方法，所述方法包括：

(1)提取精子細胞全蛋白；

(2)將精子細胞全蛋白利用基于超濾輔助樣品制備(FASP)方法進行酶解，對酶解后的肽段進行脫鹽，制備得到樣品混合肽段；

(3)對步驟(2)的樣品混合肽段采用高效液相色譜(HPLC)進行分離得各分離樣品；

(4)將步驟(3)獲得的分離的樣品采用納流液相色譜-串聯質譜分析；

(5)對質譜數據進行UNIPROT數據庫檢索，以檢測特異肽段數進行初篩，然后以BSA蛋白信號強度為標準，計算每個樣本中蛋白的相對檢測豐度；將正常個體與少弱精個體的蛋白按照其相對檢測豐度進行篩選，從而得到差異蛋白，從而得到少弱精癥相關蛋白標志物。

本發明的第二個方面，提供上述篩選檢測方法獲得的少弱精癥相關蛋白標志物。

所述少弱精癥相關蛋白標志物包括但不限于ACPP、ACRBP、AKAP3、AKAP4、AZGP1、SPACA1、PDHA2和TUBA3C。