[發(fā)明專利]一種篩選檢測少弱精癥相關蛋白標志物的方法及其應用

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202010580098.8
• 申請日: 2020-06-23
• 公開（公告）號: CN111707748A
• 公開（公告）日: 2020-09-25
• 發(fā)明（設計）人: 黃寧;張曼玉;劉曉;孫勝楠;韓超
• 申請（專利權）人: 山東立菲生物產(chǎn)業(yè)有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/34;G01N30/36;G01N30/72;G01N30/74;G01N30/88;G01N33/68
• 代理公司: 濟南圣達知識產(chǎn)權代理有限公司 37221
• 代理人: 宋海海

1.一種篩選檢測少弱精癥相關蛋白標志物的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)提取精子細胞全蛋白；

(2)將精子細胞全蛋白利用基于超濾輔助樣品制備方法進行酶解，對酶解后的肽段進行脫鹽，制備得到樣品混合肽段；

(3)對步驟(2)的樣品混合肽段采用高效液相色譜進行分離得各分離樣品；

(4)將步驟(3)獲得的分離的樣品采用納流液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析；

(5)對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行UNIPROT數(shù)據(jù)庫檢索，以檢測特異肽段數(shù)進行初篩，然后以BSA蛋白信號強度為標準，計算每個樣本中蛋白的相對檢測豐度；將正常個體與少弱精個體的蛋白按照其相對檢測豐度進行篩選，從而得到差異蛋白，從而得到少弱精癥相關蛋白標志物。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中，提取精子細胞全蛋白的具體方法包括：

將精子樣本采用DPBS洗滌，加入RIPA裂解液超聲，置于低溫孵育裂解，離心，取上層蛋白質(zhì)清液，測定清液中蛋白濃度；

優(yōu)選的，加入RIPA裂解液超聲1～2min；

低溫孵育裂解具體為：置于冰上孵育20～30min裂解；

離心具體方法為：在12,000～15,000g離心10～30min；優(yōu)選為14,000g離心20min。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中，利用基于超濾輔助樣品制備方法對蛋白進行酶解具體為：

在超濾管中加入上述上層蛋白質(zhì)清液，震蕩，離心，加入尿素，繼續(xù)震蕩離心；加入NH₄HCO₃震蕩離心；更換超濾管套管，加入BSA，并加入NH₄HCO₃溶液，再加入胰蛋白酶，過夜消化。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中，對酶解后的肽段進行脫鹽采用ziptip法進行。

5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中，高效液相色譜分離具體方法為：

樣品混合肽段用A相溶解后過柱分離，流動相梯度設置為：0-3min，100％A相，3-25min，流速始終保持為0.7mL/min；紫外檢測器UV設置為214nm，根據(jù)樣品分離的色譜圖，在10min時離心管收集液相分離餾分，每管收集1min，并按照收集的時間順序?qū)M分編號；將組分真空干燥；用乙腈水混合液溶解并交叉合并，將最終得到的組分真空干燥，低溫貯存?zhèn)溆茫?/p>

優(yōu)選的，過柱采用色譜柱為C18 XBridge BEH-130柱；

優(yōu)選的，流動相中，

A相：2％CH₃CN，98％H₂O，NH₃H₂O調(diào)pH 10.0；

B相：98％CH₃CN，2％H₂O。

6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(4)中，采用納流液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析具體方法為：

每個樣品分別用A相溶解，樣品分離之前分別用A相平衡自制的預柱和分析柱；平衡后樣品在A相的帶動下首先載樣于預柱，然后在不同梯度下進行液相分離；

150min色譜梯度變化如下：5-32％流動相B 100min，32-80％流動相B，20min，80％流動相B，30min.流速始終保持在300nL/min。

質(zhì)譜檢測條件：350-1800m/z的全掃描，分辨率為60,000(m/z 200)。二級圖譜掃描時，活化時間為10ms，隔離寬度為2m/z。碎裂方式為誘導碰撞解離，歸一化碰撞能量設定為35％，動態(tài)排出時間為90s；

納流液相色譜分離：A相：10％CH₃CN，90％H₂O，1％甲酸；B相：1％甲酸溶解在90％CH₃CN，10％H₂O。