[發明專利]一種蛋白質凝膠樣品的質譜檢測前處理方法及處理試劑盒

有效

• 申請號: 202010578728.8
• 申請日: 2020-06-23
• 公開（公告）號: CN111721939B
• 公開（公告）日: 2023-09-19
• 發明（設計）人: 尚駿;陳希;劉宜子;陳繼鋒;許夢玲;韓強強;杜博賈
• 申請（專利權）人: 譜度眾合（武漢）生命科技有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N30/89;G01N30/72;G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 武漢臻誠專利代理事務所(普通合伙) 42233
• 代理人: 胡星馳

本發明公開了一種蛋白質凝膠樣品的質譜檢測前處理方法及處理試劑盒。所述方法包括(1)膠內酶解：將蛋白質凝膠電泳的待檢測泳道部分細碎化后，經洗滌、蛋白質還原處理、蛋白質烷基化處理、蛋白酶酶解處理后，采用酸性乙腈溶液進行肽段抽提，獲得肽段?酸性乙腈溶液；(2)肽段脫鹽：將肽段?乙腈溶液，轉移至填充有具有陽離子交換作用的反相色譜填料的分離柱，采用質量分數0.1％?0.5％的三氟乙酸進行脫鹽洗滌，并采用堿性乙腈溶液洗脫，收集含有肽段的洗脫液，作為質譜檢測進樣樣品。所述包括：肽段抽提液、脫鹽清洗液、以及脫鹽洗脫液。本發明降低了對實驗條件的要求，并且縮短樣品制備時間至一半左右。

技術領域

本發明屬于蛋白質組學檢測技術領域，更具體地，涉及一種蛋白質凝膠樣品的質譜檢測前處理方法及處理試劑盒。

背景技術

目前制備用于質譜檢測的蛋白質樣本，一般是將凝膠電泳分離后的蛋白質凝膠樣品進行膠內酶解和脫鹽處理后，進行質譜檢測。質譜檢測的前處理包括以下步驟：首先切碎膠塊，依次以二硫蘇糖醇(DTT)和碘乙酰胺(IAA)對蛋白進行還原和烷基化處理，然后胰酶酶解后提取肽段溶液；在此之后需要以真空離心濃縮儀抽干肽段溶液，再用酸性溶液溶解肽段實現溶劑置換后，轉移至C18分離柱進行脫鹽，最后以高有機相洗脫肽段以備質譜檢測。

目前的蛋白質質譜檢測的前處理過程，步驟繁多，尤其需要用到真空離心濃縮儀等常規實驗室所不配置的儀器，整個制樣過程消耗時間在20至30小時之間，同時由于儀器的配置問題，有可能需要轉運蛋白質或者肽段樣本至具有相應條件的實驗室，帶來嚴重的保存及轉運問題。因此不利于規模化、商業化的檢測。

發明內容

針對現有技術的以上缺陷或改進需求，本發明提供了一種蛋白質凝膠樣品的質譜檢測前處理方法及處理試劑盒，其目的在于通過采用陽離子交換作用的反相色譜填料進行脫鹽，無需溶劑置換即可實現肽段脫鹽步驟，避免了采用真空離心濃縮儀進行溶劑抽干步驟，降低了對實驗條件的要求，大幅縮短了蛋白質凝膠質譜檢測樣品的制備時間，由此解決現有技術蛋白質質譜檢測樣品對實驗條件要求較高、處理時間長的技術問題。

為實現上述目的，按照本發明的一個方面，提供了一種蛋白質凝膠樣品的質譜檢測前處理方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)膠內酶解：將蛋白質凝膠電泳的待檢測泳道部分細碎化后，經洗滌、蛋白質還原處理、蛋白質烷基化處理、蛋白酶酶解處理后，采用酸性乙腈溶液進行肽段抽提，獲得肽段-酸性乙腈溶液；所述酸性乙腈溶液，含有3％至10％的甲酸，乙腈濃度在50％至80％之間；

(2)肽段脫鹽：將步驟(1)獲得的肽段-乙腈溶液，轉移至填充有具有陽離子交換作用的反相色譜填料的分離柱中，采用質量分數0.1％-0.5％的三氟乙酸溶液進行脫鹽洗滌，并采用堿性乙腈溶液洗脫，收集含有肽段的洗脫液，作為質譜檢測進樣樣品。

優選地，所述蛋白質凝膠樣品的質譜檢測前處理方法，所述反相色譜填料，具有陽離子交換作用，當溶液pH值呈酸性，肽段帶有正電荷從而與反相色譜填料穩固吸附，進行脫鹽洗滌后，通過洗脫液改變環境pH值，使得肽段不再帶有正電荷，從而溶解在呈堿性的洗脫液中被洗脫，優選的反相色譜填料為SDB-RPS反相色譜填料，是一種用磺酸基修飾的苯乙烯-二乙烯苯共聚物。

優選地，所述蛋白質凝膠樣品的質譜檢測前處理方法，其所述堿性乙腈溶液，含有1％-3％的NH₄OH，乙腈濃度在60％至90％之間。

優選地，所述蛋白質凝膠樣品的質譜檢測前處理方法，其所述采用三氟乙酸進行脫鹽洗滌的操作具體為：加入120-180μL含有0.1％-0.5％的三氟乙酸溶液至吸附有待脫鹽肽段的分離柱，過柱后棄液；優選洗滌操作重復1至3次；

所述采用堿性乙腈溶液洗脫的操作具體為：加入15-20μL的堿性乙腈溶液至吸附有已脫鹽肽段的分離柱，過柱后收集液相；優選洗脫操作重復2至3次。