[發(fā)明專利]一種蛋白質(zhì)凝膠樣品的質(zhì)譜檢測前處理方法及處理試劑盒有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 202010578728.8 | 申請日： | 2020-06-23 |
| 公開（公告）號： | CN111721939B | 公開（公告）日： | 2023-09-19 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 尚駿;陳希;劉宜子;陳繼鋒;許夢玲;韓強強;杜博賈 | 申請（專利權(quán)）人： | 譜度眾合（武漢）生命科技有限公司 |
| 主分類號： | G01N33/68 | 分類號： | G01N33/68;G01N30/89;G01N30/72;G01N30/02;G01N30/06 |
| 代理公司： | 武漢臻誠專利代理事務(wù)所(普通合伙) 42233 | 代理人： | 胡星馳 |
| 地址： | 430070 湖北省武漢市*** | 國省代碼： | 湖北;42 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 蛋白質(zhì) 凝膠 樣品 檢測 處理 方法 試劑盒 | ||
1.一種蛋白質(zhì)凝膠樣品的質(zhì)譜檢測前處理方法，其特征在于，包括以下步驟：
（1）膠內(nèi)酶解：將蛋白質(zhì)凝膠電泳的待檢測泳道部分細(xì)碎化后，經(jīng)洗滌、蛋白質(zhì)還原處理、蛋白質(zhì)烷基化處理、蛋白酶酶解處理后，采用酸性乙腈溶液進行肽段抽提，獲得肽段-酸性乙腈溶液；所述酸性乙腈溶液，含有3%至10%的甲酸，乙腈濃度在50%至80%之間；
（2）肽段脫鹽：將步驟（1）獲得的肽段-乙腈溶液，轉(zhuǎn)移至填充有具有陽離子交換作用的反相色譜填料的分離柱，采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%-0.5%的三氟乙酸溶液進行脫鹽洗滌，并采用堿性乙腈溶液洗脫，收集含有肽段的洗脫液，作為質(zhì)譜檢測進樣樣品；所述反相色譜填料為SDB-RPS反相色譜填料；所述堿性乙腈溶液，含有1%-3%的NH4OH；乙腈濃度在60%至90%之間；
所述反相色譜填料，具有陽離子交換作用，當(dāng)溶液pH值呈酸性，肽段帶有正電荷從而與反相色譜填料穩(wěn)固吸附，進行脫鹽洗滌后，通過洗脫液改變環(huán)境pH值，使得肽段不再帶有正電荷，從而溶解在呈堿性的洗脫液中被洗脫。
2.如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)凝膠樣品的質(zhì)譜檢測前處理方法，其特征在于，所述分離柱被包含于肽段除鹽裝置中；所述肽段除鹽裝置，由可拆卸嵌套的分離柱、適配器和收集管組成；所述分離柱為兩端開口的錐形管，距離下端3至8?mm處填充有反相色譜填料；所述收集管，采用1.5?mL的離心管；所述分離柱和收集管通過適配器同心固定，所述適配器為中心具有錐形通孔且與收集管配合的收集管蓋，所述錐形通孔與分離柱配合，使得分離柱與收集管同心固定，且分離柱一端暴露在適配器外，一端處于收集管內(nèi)部。
3.如權(quán)利要求2所述的蛋白質(zhì)凝膠樣品的質(zhì)譜檢測前處理方法，其特征在于，所述適配器具有通氣孔，用于平衡收集管內(nèi)外氣壓。
4.如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)凝膠樣品的質(zhì)譜檢測前處理方法，其特征在于，所述采用三氟乙酸進行脫鹽洗滌的操作具體為：加入120-180?μL含有0.1%-0.5%的三氟乙酸溶液至吸附有待脫鹽肽段的分離柱，過柱后棄液；洗滌操作重復(fù)1至3次；
所述采用堿性乙腈溶液洗脫的操作具體為：加入15-20?μL的堿性乙腈溶液至吸附有已脫鹽肽段的分離柱，過柱后收集液相；洗脫操作重復(fù)2至3次。
5.如權(quán)利要求2或3所述的蛋白質(zhì)凝膠樣品的質(zhì)譜檢測前處理方法，其特征在于，所述脫鹽洗滌的操作和所述洗脫的操作過柱步驟，采用所述可拆卸嵌套的分離柱、適配器和收集管組成的肽段除鹽裝置，并采用離心力加速液體過柱，采用1000?g-3000?g離心1-3?min。
6.如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)凝膠樣品的質(zhì)譜檢測前處理方法，其特征在于，步驟（1）所述蛋白質(zhì)還原處理和蛋白質(zhì)烷基化處理按照以下方法同時進行蛋白質(zhì)還原和烷基化處理：
加入凝膠體積1至3倍的還原烷基化反應(yīng)液，50?℃-95?℃孵育20-60?min；所述還原烷基化反應(yīng)液含有還原劑三(2-羧乙基)膦、以及烷基化劑氯乙酰胺，其中TCEP濃度在5-30?mM之間，CAA濃度在20-100?mM之間。
7.如權(quán)利要求6所述的蛋白質(zhì)凝膠樣品的質(zhì)譜檢測前處理方法，其特征在于，向膠塊中加入2倍膠塊體積的還原烷基化反應(yīng)液，56?℃孵育30?min，所述還原烷基化反應(yīng)液含有10mM?TCEP和40?mM?CAA的水溶液。
8.一種蛋白質(zhì)凝膠樣品的質(zhì)譜檢測前處理試劑盒，其特征在于，包括：肽段抽提液、脫鹽清洗液、脫鹽洗脫液、以及具有陽離子交換作用的反相色譜填料的分離柱；
所述肽段抽提液，為酸性乙腈溶液，乙腈濃度在50%至80%之間；含有3%至10%的甲酸；
所述脫鹽清洗液，為0.1%-0.5%的三氟乙酸進行脫鹽洗滌；
所述脫鹽洗脫液，為堿性乙腈溶液，乙腈濃度在60%至90%之間；含有1%-3%的NH4OH；
所述肽段抽提液、脫鹽清洗液、以及脫鹽洗脫液的體積比為：1:0.5-1.5:0.05-0.2；
所述反相色譜填料為SDB-RPS反相色譜填料。
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