[發(fā)明專利]一種體外培育牛黃及其制備方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010577790.5
• 申請(qǐng)日: 2020-06-22
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111658671A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-09-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 羅張龍;蔡紅嬌;徐冬平;石則勇
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 武漢健民大鵬藥業(yè)有限公司
• 主分類號(hào): A61K35/413
• 分類號(hào): A61K35/413;A61K31/575
• 代理公司: 武漢科皓知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 彭勁松

1.一種體外培育牛黃的方法，其特征在于，包含以下步驟：

1）結(jié)合膽汁酸的制備：所述結(jié)合膽汁酸為牛磺膽酸、甘氨膽酸、牛磺去氧膽酸、甘氨去氧膽酸；以牛膽汁為原料進(jìn)行以下處理：

黏多糖的去除：每升牛膽汁中加入100ml 0.02%的CTAB溶液，攪拌5min，靜置30min，過(guò)濾去除沉淀，得濾液；

②蛋白質(zhì)的去除：用氫氧化鈉將步驟的濾液pH調(diào)至10～10.5，向每升濾液中加入適量的0.02%的硫酸鋅或氯化鋅溶液，適量的 0.01%的氯化鈣或硝酸鈣溶液形成金屬鹽類復(fù)合物，過(guò)濾去除沉淀，得濾液；

結(jié)合膽汁酸混合物的獲取：用濃鹽酸將步驟②中濾液pH調(diào)至1～2，攪拌2min，靜置20min，離心收集沉淀物；

結(jié)合膽汁酸的分離：將步驟收集的沉淀物與100～200目硅膠以（5～6）:（3～4）比例直接拌樣，干燥上樣；硅膠層析柱內(nèi)徑22cm，裝柱100～200目硅膠量5kg，高度35cm；單次上樣量500～600g，拌樣硅膠量300～400g，高度5～6cm，以乙酸乙酯/甲醇/甲酸為洗脫液進(jìn)行洗脫，洗脫速度5～8ml/s，具體洗脫方式：先后經(jīng)過(guò)乙酸乙酯/甲醇/甲酸體積比=（50～90）:（0.7～1.3）:（0.7～1.3）洗脫45～65L得甘氨去氧膽酸，（70～130）:（1.4～2.6）:（0.7～1.3）洗脫30～50L得甘氨膽酸，隨后（55～105）:（14～26）:（0.7～1.3）洗脫14～26L得牛磺去氧膽酸，最后經(jīng)過(guò)（52～98）:（18～32）:（0.7～1.3）洗脫28～52L得牛磺膽酸；

2）復(fù)合膽紅素鈣的制備：取250L牛膽汁，加入牛磺酸，蒸汽滅菌，加入2.5L大腸桿菌、腸球菌、變形桿菌的單一菌液或者其組合菌液，進(jìn)行發(fā)酵，控制發(fā)酵溫度36～39℃，罐內(nèi)壓力0.45～0.5bar，pH值6～8，攪拌機(jī)轉(zhuǎn)速50～60r/min，發(fā)酵80～90h，得發(fā)酵牛膽汁240～253L，加飽和氫氧化鈣溶液，攪拌15～30min、煮沸15～20min、冷卻，過(guò)濾得沉淀物11～14kg，向沉淀物中加入膽紅素、膽酸、去氧膽酸、硫酸鋅和硫酸鎂并置于高速分散機(jī)中，加100～200L純化水?dāng)嚢?～2h，冷凍真空干燥并粉碎，得復(fù)合膽紅素鈣粉末25～35kg；

3）培育與成形：按照每100kg復(fù)合膽紅素鈣中加50～100L步驟2）中的發(fā)酵牛膽汁，100～150L純化水，添加步驟1）獲得的結(jié)合膽汁酸，助懸劑羥丙甲基纖維素，攪拌15～30min，均勻分散，靜置30～60min，加酸調(diào)節(jié)pH至5.5～6.8，偏軸定向旋轉(zhuǎn)培育形成類球形物，干燥得成品。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟1）②中，每升濾液中加入0.02%硫酸鋅或氯化鋅溶液以及0.1%氯化鈣或硝酸鈣溶液的體積均為15～25ml。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟1）中，將步驟收集的沉淀物與100-200目硅膠以5:4的比例直接拌樣，干燥上樣；硅膠層析柱內(nèi)徑22cm，裝柱硅膠量5kg，裝柱100-200目硅膠高度35cm。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟1）中，單次上樣量500g，拌樣硅膠量400g，拌樣硅膠高度5cm，具體洗脫方式：先后經(jīng)過(guò)乙酸乙酯/甲醇/甲酸體積比=70/1/1洗脫50L得甘氨去氧膽酸，100/2/1洗脫40L得甘氨膽酸，隨后80/20/1洗脫20L得牛磺去氧膽酸，最后經(jīng)過(guò)75/25/1洗脫40L得牛磺膽酸。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟2）中，向250L牛膽汁中加入7.5～15kg牛磺酸，向240-253L 發(fā)酵牛膽汁中加入240～1000L飽和氫氧化鈣溶液，向過(guò)濾得的11-14kg沉淀物中加入10～15kg膽紅素，1.5～3kg膽酸，0.8～1.5kg去氧膽酸，0.12～0.2kg硫酸鋅，0.12～0.2kg硫酸鎂。