[發(fā)明專利]一種水稻愈傷組織的超低溫保存方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010577282.7
• 申請(qǐng)日: 2020-06-23
• 公開（公告）號(hào): CN111657272B
• 公開（公告）日: 2022-05-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李天菲;滕小英;周麗;韓靜;林田;楊華;劉鴻艷;龍萍;羅利軍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海市農(nóng)業(yè)生物基因中心
• 主分類號(hào): A01N3/00
• 分類號(hào): A01N3/00;A01H4/00
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• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明涉及一種水稻愈傷組織的超低溫保存方法；包括挑選健康成熟的水稻種子，消毒滅菌后接種到含有3mg/L 2,4?D的NB培養(yǎng)基上誘導(dǎo)長出初生愈傷組織，再轉(zhuǎn)接到含有2mg/L 2,4?D的NB培養(yǎng)基上繼代增殖，擴(kuò)繁后的愈傷用篩網(wǎng)篩選出胚性愈傷顆粒，轉(zhuǎn)入含有100g/L蔗糖和2mg/L 2,4?D的NB培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)，預(yù)培養(yǎng)后的愈傷直接進(jìn)行超低溫凍存。解凍時(shí)從液氮中取出凍存管，立即放入39?41℃水浴中快速解凍2?4min，然后將愈傷接種到含有2mg/L 2,4?D的NB培養(yǎng)基上恢復(fù)培養(yǎng)，待新生愈傷長出后，挑取新生愈傷進(jìn)行分化培養(yǎng)至綠苗長出。本發(fā)明的水稻愈傷超低溫保存方法簡(jiǎn)便易行，穩(wěn)定可靠，且超低溫保存后愈傷存活率高，分化成苗率高。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于植物細(xì)胞工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種植物超低溫保存方法，具體涉及一種水稻愈傷組織的超低溫保存方法。

背景技術(shù)

水稻是全球最主要的三大糧食作物之一，也是亞洲最主要的糧食作物。豐富的水稻遺傳資源和不斷改良的優(yōu)良水稻品種，保障了全球約半數(shù)人口的糧食需求。但隨著現(xiàn)代人類急速擴(kuò)張的經(jīng)濟(jì)活動(dòng)，全球工業(yè)化背景下迅速惡化的自然環(huán)境及不利的氣候條件，導(dǎo)致了水稻種植面積日益減少，水稻產(chǎn)量受到影響；同時(shí)機(jī)械化規(guī)模化種植方式的推廣，以產(chǎn)量為主導(dǎo)的育種策略，使得應(yīng)用的水稻品種越來越單一化，資源的遺傳基礎(chǔ)變得狹窄，遺傳多樣性逐漸喪失，原來自然資源中的抗蟲抗病耐旱耐淹等抗逆基因漸漸被丟失。因此當(dāng)前形勢(shì)下對(duì)水稻種質(zhì)資源遺傳多樣性的保護(hù)已刻不容緩。

目前，我國對(duì)水稻種質(zhì)資源的保存方式主要以種子保存的種質(zhì)庫為主，但低溫種質(zhì)庫建設(shè)成本高，運(yùn)行維護(hù)費(fèi)用高昂，有條件有能力建設(shè)的種質(zhì)庫單位還很少。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，植物組織與細(xì)胞的培養(yǎng)為植物種質(zhì)保存開辟了新的途徑，組織培養(yǎng)物能快速大量繁殖,再生植株可保持原有的遺傳特性。而超低溫保存(-196℃)條件下，植物的生物化學(xué)活性近乎停止，貯藏過程中的生理和遺傳變化能夠控制在最低限度內(nèi)，避免了遺傳性狀變異或污染的危險(xiǎn)，被認(rèn)為是植物遺傳資源長期保存的最優(yōu)選擇。

開展植物超低溫保存研究以來，超低溫保存技術(shù)和保存效率上不斷提升，超低溫保存的植物種類也在不斷地增長，但多數(shù)應(yīng)用在蘋果、櫻桃、柑桔、香蕉、木薯等木本植物以及馬鈴薯、紅薯、草莓等經(jīng)濟(jì)植物上。水稻的超低溫保存最早開始于1979年Sala等報(bào)道的水稻懸浮細(xì)胞的超低溫保存，此后相關(guān)研究也多集中在利用懸浮細(xì)胞系的作為超低溫保存材料。一直以來對(duì)水稻種質(zhì)資源的超低溫保存研究很少，除懸浮細(xì)胞外的保存材料也寥寥無幾，僅1996年殷曉輝教授通過程序降溫儀對(duì)野生稻愈傷進(jìn)行超低溫保存研究，獲得凍后再生植株。2000年章志宏教授等采用程序降溫法對(duì)水稻幼穗離體培養(yǎng)誘導(dǎo)的不定芽進(jìn)行超低溫保存，得到再生植株。2016年上海市農(nóng)業(yè)生物基因中心林田等用莖尖玻璃化的方法保存了普通野生稻種質(zhì)資源。但上述保存方法往往步驟較繁瑣，對(duì)設(shè)備要求(如程序降溫儀)或材料要求(如莖尖、幼穗等材料細(xì)小幼嫩，取材操作難度大)都比較高，不利于推廣應(yīng)用，因此探索易獲取易繁殖的組織材料，建立更簡(jiǎn)便高效低成本的水稻超低溫保存方法是亟需和必要的。

發(fā)明內(nèi)容

現(xiàn)有的水稻超低溫保存方法對(duì)設(shè)備要求和操作技術(shù)要求高，且過程較繁瑣，污染幾率大，不利于廣泛應(yīng)用。本發(fā)明的目的是提供一種簡(jiǎn)便高效，成本低廉的水稻愈傷組織的超低溫保存方法，為水稻種質(zhì)資源的長期安全保存提供了一條適用廣效率高的途徑，也對(duì)其他禾本科植物的超低溫保存方法有一定指導(dǎo)意義。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明提供了一種水稻愈傷組織的超低溫保存方法，包括如下步驟：

步驟A1：取健康成熟的水稻種子，消毒滅菌后接種到含有2-3mg/L 2,4-D的NB培養(yǎng)基上誘導(dǎo)初生愈傷組織；

步驟A2：挑取初生愈傷組織，轉(zhuǎn)接到含有2mg/L 2,4-D的NB培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)；

步驟A3：增殖擴(kuò)繁后的愈傷組織，用篩網(wǎng)篩選出特定大小的愈傷顆粒，轉(zhuǎn)入含有100g/L蔗糖或麥芽糖、和2mg/L 2,4-D的NB培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)7-10天；