[發(fā)明專利]一種水稻愈傷組織的超低溫保存方法有效
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 202010577282.7 | 申請(qǐng)日： | 2020-06-23 |
| 公開(kāi)（公告）號(hào)： | CN111657272B | 公開(kāi)（公告）日： | 2022-05-24 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 李天菲;滕小英;周麗;韓靜;林田;楊華;劉鴻艷;龍萍;羅利軍 | 申請(qǐng)（專利權(quán)）人： | 上海市農(nóng)業(yè)生物基因中心 |
| 主分類號(hào)： | A01N3/00 | 分類號(hào)： | A01N3/00;A01H4/00 |
| 代理公司： | 暫無(wú)信息 | 代理人： | 暫無(wú)信息 |
| 地址： | 201106 *** | 國(guó)省代碼： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 水稻 組織 超低溫 保存 方法 | ||
1.一種水稻愈傷組織的超低溫保存方法，其特征在于，所述保存方法由以下步驟組成：
步驟A1：取健康成熟的水稻種子，消毒滅菌后接種到含有2-3mg/L 2,4-D的NB培養(yǎng)基上誘導(dǎo)初生愈傷組織；
步驟A2：挑取初生愈傷組織，轉(zhuǎn)接到含有2mg/L 2,4-D的NB培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)；
步驟A3：增殖擴(kuò)繁后的愈傷組織，用篩網(wǎng)篩選出特定大小的愈傷顆粒，轉(zhuǎn)入含有100g/L蔗糖和2mg/L 2,4-D的NB培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)7-10天；
步驟A4：將預(yù)培養(yǎng)后的愈傷組織直接裝入凍存管，每支凍存管裝載量不超過(guò)1/2，然后迅速投入液氮中保存；
NB培養(yǎng)基為1L培養(yǎng)基中含有463mg (NH4)2· SO4, 125.33mg CaCl2, 90.37mg MgSO4,400mg KH2PO4, 2830mg KNO3, 3mg H3BO3, 0.025mg CoCl2·6H2O, 0.025 CuSO4·5H2O,27.8mg FeSO4·7H2O, 37.26mg Na2-EDTA·2H2O, 10mg MnSO4·H2O, 0.25mgNa2NoO4.2H2O, 0.75mg KI, 2mg ZnSO4·7H2O, 100mg肌醇，1mg 煙酸, 1mg 鹽酸吡哆醇,10mg煙酸硫胺素, 30g蔗糖，7g瓊脂粉，余量為水，調(diào)整pH值為5.9；
步驟A3中，用篩網(wǎng)篩選出直徑1.5-3mm大小的胚性愈傷顆粒進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)；所述預(yù)培養(yǎng)的條件為26-28℃暗培養(yǎng)；
所述方法超低溫保存后的水稻愈傷組織的恢復(fù)培養(yǎng)方法包括如下步驟：
步驟B1：從液氮中取出凍存管，立即放入39-41℃水浴中快速解凍2-4min；
步驟B2：將解凍后的愈傷接種到含有2mg/L 2,4-D的NB培養(yǎng)基上恢復(fù)培養(yǎng)10-14天，恢復(fù)培養(yǎng)條件為28-30℃暗培養(yǎng)，直至新生愈傷長(zhǎng)出；所述恢復(fù)培養(yǎng)前在超凈臺(tái)工作中將凍存管里解凍的愈傷組織轉(zhuǎn)到無(wú)菌濾紙上，自然風(fēng)干8～12min，再轉(zhuǎn)接到恢復(fù)培養(yǎng)基上進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水稻愈傷組織的超低溫保存方法，其特征在于，步驟A1中，誘導(dǎo)培養(yǎng)條件為30℃，光照12h/天，光照強(qiáng)度1000-1200lux。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水稻愈傷組織的超低溫保存方法，其特征在于，步驟A2中，繼代增殖培養(yǎng)條件為26-28℃暗培養(yǎng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水稻愈傷組織的超低溫保存方法，其特征在于，利用不同目數(shù)的篩網(wǎng)，篩選出偏圓粒狀、淺黃色，質(zhì)地致密，1.5-3mm大小的胚性愈傷顆粒。
5.一種水稻愈傷組織超低溫保存后分化成苗的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：第一步按照權(quán)利要求1所述方法進(jìn)行水稻愈傷組織的超低溫保存, 第二步挑取如權(quán)利要求1所述方法恢復(fù)培養(yǎng)后長(zhǎng)出的新生愈傷組織，轉(zhuǎn)入含有2.0mg/L 6-BA, 2.0mg/LKT , 0.2mg/L IAA 和0.2mg/L NAA的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行分化培養(yǎng)，培養(yǎng)20-30天分化出綠苗。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的水稻愈傷組織超低溫保存后分化成苗的培養(yǎng)方法，其特征在于，分化培養(yǎng)條件為25℃，光照12h/天，光照強(qiáng)度4000-5000lux。
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