[發明專利]一種檢測肺癌循環腫瘤細胞的方法

在審

• 申請號: 202010576943.4
• 申請日: 2020-06-22
• 公開（公告）號: CN111812324A
• 公開（公告）日: 2020-10-23
• 發明（設計）人: 陳寶安;王雪融;周芳
• 申請（專利權）人: 東南大學
• 主分類號: G01N33/574
• 分類號: G01N33/574;G01N33/569;G01N33/58
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 冒艷

本發明公開了一種檢測肺癌循環腫瘤細胞的方法，采集肺小結節患者外周血，加入紅細胞裂解液合并離心的方法去除紅細胞，再用連接磁珠的CD45抗體磁性分離去除白細胞。剩余的循環細胞經洗滌、沉淀，進行涂片。用CEP8熒光探針、EpCAM抗體和Pan?CK抗體進行染色，并在激光共聚焦顯微鏡下進行掃描。采集信號，并進行讀片，判定并計數CTCs。本發明的顯著優點為所需標本量少，與單一marker檢測法相比較，對CTCs的檢出量多，檢出率更高，檢測效果好。

技術領域

本發明涉及細胞的檢測方法，特別涉及一種檢測肺癌循環腫瘤細胞的方法。

背景技術

循環腫瘤細胞(Circulating Tumor Cells，CTCs)是腫瘤組織脫落的，進入血液循環的少量腫瘤細胞。研究表明，在腫瘤發生發展的各個階段均可用不同的方法，在患者的外周血中檢測到CTCs。目前，CellSearch是經美國FDA批準的CTCs收集和鑒定，進而輔助診斷惡性腫瘤的技術方法。該技術采用腫瘤細胞表面EpCAM和Cytokeratin蛋白表達增多的特點，利用磁珠連接識別并結合該蛋白的特異性的抗體，對采集自15ml人外周血中的CTCs進行富集，并進一步用免疫熒光的方法進行鑒定。該方法與其他方式聯合應用，可以監控表面標志物EpCAM+/Cytokeratin+的腫瘤細胞，用于前列腺癌、乳腺癌、結直腸癌的輔助診斷。但是，對于這兩個標志物陰性的循環腫瘤細胞則無法檢出。存在漏檢的問題。

發明內容

發明目的：本發明目的是提供一種避免漏檢、檢出量大、效果好的檢測肺癌循環腫瘤細胞的方法。本發明方法應用CD45免疫熒光和CEP8熒光原位雜交、EpCAM和Pan-CK標記物免疫熒光聯合檢測肺小結節患者外周血樣本。

技術方案：本發明提供一種檢測肺癌循環腫瘤細胞的方法，采集外周血，加入紅細胞裂解液合并離心的方法去除紅細胞，再用連接磁珠的CD45抗體磁性分離去除白細胞，剩余的循環細胞經洗滌、沉淀，進行涂片，依次用CEP8熒光探針、EpCAM抗體和Pan-CK抗體進行染色、掃描、采集信號、讀片、計數CTCs。

進一步地，所述方法，包括如下步驟：

(1)用ACD抗凝管收集外周靜脈血；

(2)采用紅細胞裂解緩沖液CS2(Cyttel)裂解紅細胞，離心，去除紅細胞；

(3)離心后的細胞沉淀在CS1(Cyttel)中重懸，然后與抗CD45抗體結合免疫磁珠孵育，梯度離心，去除白細胞；

(4)將含有CTCs的剩余溶液涂抹在載玻片上；

(5)載玻片用枸櫞酸鈉溶液(SSC)浸泡，然后用乙醇脫水；

(6)將CEP8添加到載玻片上，變性、雜交后用甲酰胺浸泡，用枸櫞酸鈉溶液(SSC)孵育2-3次；

(7)將載玻片在乙醇中再次脫水，將細胞與CD45在室溫下孵育，然后用BSA洗滌，用含有DAPI的封固劑進行固定；

(8)將載玻片用PBS浸沒，去掉蓋玻片，并用CYP1洗載玻片；

(9)吸去多余液體，加稀釋好的Pan-CK和EpCAM抗體，避光孵育；

(10)避光下，取CYP2洗片，吸去多余液體；

(11)加稀釋好的熒光抗體DGG和DMO，避光孵育，CYP2洗片，吸去多余液體；

(16)復染：將DAPI管瞬時離心后，液面處取DAPI染液，加至標本區；

(17)蓋片：蓋上蓋玻片，吸去周邊液體，鏡下觀察，重新核對CD45陰性細胞，以確定CEP8、pan-CK和EpCAM的表達；

(18)閱片；