[發明專利]一種檢測肺癌循環腫瘤細胞的方法

在審

• 申請號: 202010576943.4
• 申請日: 2020-06-22
• 公開（公告）號: CN111812324A
• 公開（公告）日: 2020-10-23
• 發明（設計）人: 陳寶安;王雪融;周芳
• 申請（專利權）人: 東南大學
• 主分類號: G01N33/574
• 分類號: G01N33/574;G01N33/569;G01N33/58
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 冒艷

1.一種檢測肺癌循環腫瘤細胞的方法，其特征在于：采集外周血，加入紅細胞裂解液合并離心的方法去除紅細胞，再用連接磁珠的CD45抗體磁性分離去除白細胞，剩余的循環細胞經洗滌、沉淀、涂片，依次用CEP8熒光探針、EpCAM抗體和Pan-CK抗體進行染色、掃描、采集信號、讀片、計數。

2.根據權利要求1所述的檢測肺癌循環腫瘤細胞的方法，其特征在于：包括如下步驟：

(1)用ACD抗凝管收集外周靜脈血；

(2)采用紅細胞裂解緩沖液CS2(Cyttel)裂解紅細胞，離心，去除紅細胞；

(3)離心后的細胞沉淀在CS1(Cyttel)中重懸，然后與抗CD45抗體結合免疫磁珠孵育，梯度離心，去除白細胞；

(4)將含有CTCs的剩余溶液涂抹在載玻片上；

(5)載玻片用枸櫞酸鈉溶液(SSC)浸泡，然后用乙醇脫水；

(6)將CEP8添加到載玻片上，變性、雜交后用甲酰胺浸泡，用枸櫞酸鈉溶液(SSC)孵育2-3次；

(7)將載玻片在乙醇中再次脫水，將細胞與CD45在室溫下孵育，然后用BSA洗滌，用含有DAPI的封固劑進行固定；

(8)將載玻片用PBS浸沒，去掉蓋玻片，并用CYP1洗載玻片；

(9)吸去多余液體，加稀釋好的Pan-CK和EpCAM抗體，避光孵育；

(10)避光下，取CYP2洗片，吸去多余液體；

(11)加稀釋好的熒光抗體DGG和DMO，避光孵育，CYP2洗片，吸去多余液體；

(12)復染：將DAPI管瞬時離心后，液面處取DAPI染液，加至標本區；

(13)蓋片：蓋上蓋玻片，吸去周邊液體，鏡下觀察，重新核對CD45陰性細胞，以確定CEP8、pan-CK和EpCAM的表達；

(14)閱片；

(15)結果判定：pan-CK+或EpCAM+或CEP8+且CD45-和DAPI+特征的細胞被是循環腫瘤細胞(CTCs)。

3.根據權利要求2所述的檢測肺癌循環腫瘤細胞的方法，其特征在于：所述步驟(5)中用75％、85％和100％乙醇脫水。

4.根據權利要求2所述的檢測肺癌循環腫瘤細胞的方法，其特征在于：所述步驟(7)中載玻片分別在75％、85％和100％乙醇中再次脫水。

5.根據權利要求2所述的檢測肺癌循環腫瘤細胞的方法，其特征在于：所述步驟(14)閱片采用奧林巴斯BX63顯微鏡觀察載玻片。

6.根據權利要求2所述的檢測肺癌循環腫瘤細胞的方法，其特征在于：所述步驟(9)避光孵育1.5-2h。

7.根據權利要求2所述的檢測肺癌循環腫瘤細胞的方法，其特征在于：所述步驟(11)避光孵育25～30min。