[發(fā)明專利]一種捕獲文庫構(gòu)建方法及應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010573877.5
• 申請(qǐng)日: 2020-06-22
• 公開（公告）號(hào): CN111690988A
• 公開（公告）日: 2020-09-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 覃振東;王梁輝;楊敬敏;高鵬飛;唐嘉婕
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海韋翰斯生物醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號(hào): C40B50/06
• 分類號(hào): C40B50/06;C12Q1/6806;C12Q1/6869
• 代理公司: 上海光華專利事務(wù)所(普通合伙) 31219
• 代理人: 朱凌嬌;許亦琳

本發(fā)明提供一種捕獲文庫構(gòu)建方法，至少包括以下步驟：1）將片段化的DNA與接頭連接，獲得預(yù)文庫；2）利用擴(kuò)增引物對(duì)預(yù)文庫進(jìn)行擴(kuò)增，獲得富集文庫；所述擴(kuò)增引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物或下游引物的一端設(shè)有修飾基團(tuán)；或者，所述上游引物和下游引物的一端同時(shí)設(shè)有不同的修飾基團(tuán)；所述富集文庫中包括雙鏈DNA；3）使用核酸酶消化所述富集文庫，使得所述富集文庫中的雙鏈DNA的一條單鏈被消化；4）在不存在接頭封閉序列或存在低于正常工作體積的接頭封閉序列的情況下，將步驟3）獲得的產(chǎn)物與雜交探針進(jìn)行雜交捕獲，獲得捕獲文庫。本發(fā)明可以在不加或減少封閉序列的前提下，保持較好的捕獲效率，顯著降低測(cè)序成本。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因測(cè)序領(lǐng)域，特別是涉及一種捕獲文庫構(gòu)建方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)

在二代測(cè)序中，常需要對(duì)特定基因組目標(biāo)區(qū)域測(cè)序。目標(biāo)區(qū)域測(cè)序，比較常用的方法是利用DNA或RNA探針雜交捕獲目標(biāo)基因或基因組區(qū)域的DNA片段，以提高測(cè)序的深度、準(zhǔn)確性和靈敏度。雜交捕獲過程中會(huì)用到一種必不可少的試劑-接頭封閉序列。接頭封閉序列是用來封閉文庫的接頭序列，防止引起二次雜交。如圖1所示，雜交時(shí)雙鏈文庫變性為單鏈，單鏈文庫中每個(gè)分子帶有相同的接頭序列，雜交過程中，與探針結(jié)合的單鏈文庫分子，其接頭序列部分，可能會(huì)結(jié)合其他非目標(biāo)區(qū)域的單鏈文庫分子。造成捕獲特異性下降。如圖2所示，接頭封閉序列與接頭序列堿基互補(bǔ)配對(duì)，使其不能與其它的接頭序列互補(bǔ)，由此提高捕獲的特異性。

二代測(cè)序接頭，均可被接頭封閉序列高效封閉，顯著提高中靶率。但是，接頭封閉序列的成本較高，在整個(gè)雜交捕獲過程的總成本中占了比較大的比例。雜交捕獲文庫構(gòu)建過程中，如果可以省略或降低使用接頭封閉序列，同時(shí)保持較高的中靶率，可以明顯節(jié)省實(shí)驗(yàn)成本。

發(fā)明內(nèi)容

鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供一種捕獲文庫構(gòu)建方法及應(yīng)用。

本發(fā)明第一方面提供一種捕獲文庫構(gòu)建方法，至少包括以下步驟：

1)將片段化的DNA與接頭連接，獲得預(yù)文庫；

2)利用擴(kuò)增引物對(duì)預(yù)文庫進(jìn)行擴(kuò)增，獲得富集文庫；所述擴(kuò)增引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物或下游引物的一端設(shè)有修飾基團(tuán)；或者，所述上游引物和下游引物的一端同時(shí)設(shè)有不同的修飾基團(tuán)；所述富集文庫中包括雙鏈DNA；

3)使用核酸酶消化所述富集文庫，使得所述富集文庫中的雙鏈DNA的一條單鏈被消化；

4)在不存在接頭封閉序列或存在低于正常工作體積的接頭封閉序列的情況下，將步驟3)獲得的產(chǎn)物與雜交探針進(jìn)行雜交捕獲，獲得捕獲文庫。

本發(fā)明第二方面提供一種用于構(gòu)建捕獲文庫的試劑盒，所述試劑盒包括：

(1)用于連接接頭的試劑，包括接頭；

(2)用于PCR擴(kuò)增的試劑，包括擴(kuò)增引物，所述擴(kuò)增引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物或下游引物的一端設(shè)有修飾基團(tuán)；或者，所述上游引物和下游引物的一端同時(shí)設(shè)有不同的修飾基團(tuán)；

(3)用于雜交的試劑，不包括封閉序列。

本發(fā)明第三方面提供一種捕獲文庫，采用前述的捕獲文庫構(gòu)建方法或前述用于構(gòu)建捕獲文庫的試劑盒構(gòu)建。

如上所述，本發(fā)明的一種捕獲文庫構(gòu)建方法及應(yīng)用，具有以下有益效果：

本發(fā)明所述方法通過用核酸酶消化其中一條文庫單鏈，產(chǎn)生的單鏈文庫用于雜交，直接避免了雜交過程中文庫互補(bǔ)單鏈間由于接頭序列互補(bǔ)導(dǎo)致的二次雜交，從而提高捕獲特異性。可以在不加或少量封閉序列的前提下，保持較好的捕獲效率，顯著降低測(cè)序成本。

附圖說明

圖1：現(xiàn)有技術(shù)中，無封閉接頭序列時(shí)，雜交捕獲過程示意圖。