[發明專利]一種哺乳動物啟動子活性評價質粒載體及應用

有效

• 申請號: 202010571011.0
• 申請日: 2020-06-22
• 公開（公告）號: CN112029797B
• 公開（公告）日: 2022-06-07
• 發明（設計）人: 劉馨慧;黃華;李歡
• 申請（專利權）人: 北京工業大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12Q1/6897
• 代理公司: 北京思海天達知識產權代理有限公司 11203
• 代理人: 劉萍

一種哺乳動物啟動子活性評價質粒載體及應用屬于基因工程領域，具體涉及一種基于目的蛋白連接Cre重組酶與Lox2272?Loxp序列特異識別實現評價目的蛋白與基因啟動子相互作用的方案。通過Cre重組酶與Lox2272?Loxp序列的特異性識別，實現啟動子先反轉，后啟動，從而實現下游的螢火蟲熒光素酶延遲轉錄。該方案的優勢可極大降低熒光素酶背景，使熒光素酶滯后于目的蛋白表達，更靈敏反應目的蛋白對靶基因啟動子的調控作用。本發明提供了一套瞬時轉染質粒載體，其能夠實現蛋白與啟動子互相作用高靈敏分析。載體A其核苷酸序列如Seq ID No.1所示；載體B其：核苷酸序列如Seq ID No.2所示。

技術領域

本發明屬于基因工程領域，具體涉及一種基于目的蛋白連接Cre重組酶與Lox2272-Loxp序列特異識別實現評價目的蛋白與基因啟動子相互作用的方案。特別涉及一種通過Cre重組酶與Lox2272-Loxp序列的特異性識別，實現啟動子序列的反轉，從而實現啟動子下游的螢火蟲熒光素酶得以表達。該方案的優勢可極大降低熒光素酶背景，使熒光素酶的表達滯后于目的蛋白表達，更靈敏反應目的蛋白對靶基因啟動子的調控作用。

背景技術

1.DNA與蛋白相互作用的研究

在許多的細胞生命活動中，例如DNA復制、mRNA轉錄與修飾以及病毒的感染等都涉及到DNA與蛋白質之間的相互作用的問題。隨著DNA重組技術的發展，人們已經分離得到了很多重要基因，且對基因的調控研究越發趨于透徹。在DNA與蛋白相互作用的研究中，科研工作者取得了越來越多豐碩的成果，但是細胞內的調控屬于類似網狀結構，錯綜復雜，給科研工作帶來了很多挑戰。然而，了解DNA與蛋白互作對生命科學和臨床醫學研究至關重要，目前研究表明，DNA與蛋白的互作可以調控基因的轉錄，翻譯，表觀遺傳修飾等重要的生理過程。目前研究DNA-蛋白質相互作用的經典實驗方法主要包括：1、凝膠阻滯法；2、DNaseI足跡法；3、甲基化干擾法；4、體內足跡法與下拉實驗法。

凝膠阻滯法，又稱為DNA遷移率變動實驗，或條帶阻滯實驗，產生于80年代初期，其原理主要是在凝膠電泳中，由于電場的作用，DNA分子在電場中由負極向正極泳動的速度與距離與DNA分子量成反比。若DNA分子與某個蛋白結合，則會改變DNA 的整體分子質量，從而使其在凝膠電泳中受到阻滯，使得泳動距離縮短，呈現片狀彌散的放射狀條帶，從而可判定DNA與某個蛋白存在相互作用。該方法操作簡便，可以用于鑒定在特殊類型細胞蛋白質提取物中，是否存在能同某一特定的DNA(含有轉錄因子結合位點)結合的轉錄因子蛋白質。但該方法陰性率較高，某些DNA與蛋白的互作須在輔助作用因子的參與下進行，或在體內的互作具有嚴格的時空效應。因此，采用該方式進行時，只能判斷直接與DNA分子有較強親和力的直接作用蛋白，對于復雜的多因素互相作用，該方式無法進一步判別。

在上一步方案的基礎上，科學家又發展了DNaseI足跡實驗，一種用來檢測被特定轉錄因子蛋白質特異性結合的DNA序列的位置及其核苷酸序列結構的專門實驗方法。當DNA分子中的某一區段同特異的轉錄因子結合之后便可以得到保護而免受DNaseI 酶的切割作用，而不會產生出相應的切割分子，結果在凝膠電泳放射性自顯影圖片上便出現了一個空白區，俗稱為足跡。如果蛋白質提取物中不存在與DNA結合的特定蛋白質，使DNaseI消化之后，便會產生出距離放射性標記末端1個核苷酸，2個核苷酸， 3個核苷酸--等等一系列前后長度均相差一個核苷酸的不間斷的DNA片段集合。如果 DNA分子同蛋白質提取物中的某種轉錄因子結合，被結合部位的DNA就可以得到保護免受DNaseI酶的降解作用。實驗組凝膠電泳顯示的序列，出現空白的區域表明是轉錄因子蛋白質結合部；與對照組序列比較，便可以得出蛋白質結合部位的DNA區段相應的核苷酸序列。該實驗方法具有較高的靈敏度，但是需要精細的操作和反復的摸索嘗試，從多次的結果中按照概率進行統計分析，同時，該實驗較多的應用同位素標記，對實驗人員的安全也有一定的挑戰。