[發明專利]一種哺乳動物啟動子活性評價質粒載體及應用

有效

• 申請號: 202010571011.0
• 申請日: 2020-06-22
• 公開（公告）號: CN112029797B
• 公開（公告）日: 2022-06-07
• 發明（設計）人: 劉馨慧;黃華;李歡
• 申請（專利權）人: 北京工業大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12Q1/6897
• 代理公司: 北京思海天達知識產權代理有限公司 11203
• 代理人: 劉萍

1.質粒載體，其特征在于，包括載體A和載體B；其中載體A具體為：在真核啟動子下游，具有載體限制性內切酶線性化位點EcoRI，在EcoRI酶切位點下游，連接有IRES2核糖體進入元件，在IRES2核糖體進入元件下游，連接有ZsGreen綠色熒光蛋白編碼序列；Cre重組酶編碼序列與ZsGreen綠色熒光蛋白編碼序列采用T2A連接肽編碼序列相連接，且中間帶有GSG柔性連接肽段編碼序列；

載體B具體為：在真核廣譜啟動子下游連接有海腎熒光素酶蛋白(hRluc)和殺稻瘟菌素抗性蛋白(BSD)表達框，hRluc與BSD編碼序列通過P2A連接肽編碼序列相連接；在啟動子插入位點的上游，載體B包含cer region元件，PolyA序列及pause site轉錄終止序列；在pause site轉錄終止序列下游，包含Loxp與Lox2273組合元件，該組合元件包含一對反向LoxP序列和一對反向Loxp2272序列，同時，在Loxp與Lox2272組合元件中間，設計有一對BbsI酶切位點，該位點為啟動子插入位點；在組合元件下游包含熒光蟲熒光素酶編碼序列。

2.如權利要求1所述質粒載體，其特征在于，載體A核苷酸序列如Seq ID No.1所示，載體B核苷酸序列如Seq ID No.2所示。

3.如權利要求1所述質粒載體，其特征在于，載體A的真核啟動子為CMV啟動子，CMV啟動子包含CMV增強子，CMV核心啟動子；其中CMV增強子位置與序列如Seq ID No.1第235至614位所示；CMV核心啟動子位置與序列如Seq ID No.1第615至818位所示；

載體A包括IRES2元件、ZsGreen綠色熒光蛋白編碼序列、T2A連接肽編碼序列、GSG柔性肽編碼序列及Cre重組酶編碼序列；其中IRES2元件序列如Seq ID No.1第901至1487位所示；ZsGreen綠色熒光蛋白編碼序列如Seq ID No.1第1488至2180位所示，GSG柔性肽核苷酸序列如Seq ID No 1第2181至2198位所示；T2A連接肽位置及序列如Seq ID No.1第2199至2252位所示；Cre重組酶編碼序列如Seq ID No 1第2259至3290位所示；

載體A包含嘌呤霉素篩選標記，其啟動子為SV40啟動子，位置與序列如Seq ID No.1第4028到4357位所示；嘌呤霉素編碼序列與序列信息如Seq ID No.1第4424到5023所示；

載體B核苷酸序列如Seq ID No.2所示，載體B的hRlu-P2A-BSD表達框真核啟動子為SV40啟動子，SV40啟動子位置與序列如Seq ID No.2第1至358 位所示；其中，hRluc位置與序列如Seq ID No.2第409到1341位所示；P2A連接肽位置與序列如Seq ID No.2第1390到1446位所示；BSD抗性蛋白編碼序列位置與序列如Seq ID No.2第1453到1851位所示；

載體B包含Cer Region元件與轉錄終止組合元件，Cer Region元件位置與序列如SeqID No.2第3956到4239位所示；轉錄終止組合元件包含PolyA序列與pause site轉錄終止元件，其中PolyA信號位置與序列信息如Seq ID No.2第4299到4347所示；pause site元件位置與序列信息如Seq ID No.2第4361到4452所示；載體B包含Loxp與Lox2273組合元件，其位置與序列信息如Seq ID No.2第4472到4730所示；載體B包含螢火蟲熒光素酶蛋白編碼序列，其位置與序列信息如Seq ID No.2第4733到6385所示。

4.如權利要求1所述質粒載體，其特征在于，載體A的重組構建方法；包括：在EcoRI酶切位點下游連接有IRES序列，將IRES序列與熒光蛋白編碼序列進行連接，熒光蛋白無終止密碼子，在熒光蛋白下游通過T2A連接肽與Cre重組酶蛋白相連接，在熒光蛋白與T2A中間，插入有GSG柔性肽編碼序列；插入基因、熒光蛋白及Cre重組酶均由CMV啟動子所驅動，且均為非融合表達；其中熒光蛋白、Cre重組酶，表達豐度弱于插入基因，表達時間滯后于目的基因。