[發明專利]靶向線粒體負載shRNA的納米材料及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 202010570215.2
• 申請日: 2020-06-21
• 公開（公告）號: CN111635911A
• 公開（公告）日: 2020-09-08
• 發明（設計）人: 趙綺毅;劉嘉煜;梁蕙欣
• 申請（專利權）人: 中山大學附屬第三醫院
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/87;B82Y5/00;B82Y40/00
• 代理公司: 福州科揚專利事務所 35001
• 代理人: 吳嘉濱

本發明涉及靶向線粒體負載shRNA的納米材料，以相互電荷吸附的線粒體靶向肽和shRNA表達載體為核心形成復合物后共價連接pH響應聚合物，所述納米材料通過如下步驟制備得到：（1）合成pH響應聚合物Meo?PEG?b?PDPA和線粒體靶向肽；（2）使用pLKO.1?puro載體質粒構建shRNA表達載體；（3）將合成的Meo?PEG?b?PDPA溶解在二甲基甲酰胺中形成均相溶液；（4）將合成的shRNA表達載體溶于去離子水中形成溶液；同時將合成的線粒體靶向肽溶于二甲基亞砜中形成溶液；（5）將shRNA表達載體水溶液和線粒體靶向肽二甲亞砜溶液混合后，再與Meo?PEG?b?PDPA均相溶液混合；混合液經強力攪拌后混合液滴加到去離子水中，形成靶向線粒體負載shRNA的納米顆粒；（6）將靶向線粒體負載shRNA的納米顆粒洗滌、除雜、定容。

技術領域

本發明涉及靶向線粒體負載shRNA的納米材料及其制備方法和應用，屬于納米材料技術領域。

背景技術

線粒體是一種存在于大多數細胞中的由兩層膜包被的細胞器，直徑在在0.5到10微米左右。大多數真核細胞擁有線粒體，但它們各自擁有的線粒體在大小、數量及外觀等方面上都有所不同。線粒體擁有自身的遺傳物質和遺傳體系，但因其基因組大小有限，所以線粒體是一種半自主細胞器，是細胞中制造能量的結構，細胞進行有氧呼吸的主要場所，為細胞的活動提供了能量。由于線粒體在維持生命穩態中發揮著重要作用，涉及細胞能量障礙及氧化損傷的多種疾病(如神經退行性疾病、癌癥、衰老、心血管疾病等)都與線粒體的功能紊亂相關，因此，完善線粒體的研究，深入了解它的功能，將為疾病防治提供新策略。

shRNA即“短發夾RNA”，包括兩個短反向重復序列，中間由一莖環(loop)序列分隔。通常，shRNA的表達受RNA聚合酶(Pol)III啟動子或修飾的pol II啟動子控制。轉錄shRNA后，通過莖環連接的正義鏈和反義鏈成對一起形成特征性發夾結構；shRNA可加工成siRNA，也可通過與目標mRNA互補結合序列特異性地實現靶mRNA降解；shRNA是一種通過基因沉默抑制蛋白表達的工具，shRNA在轉染/轉導細胞的細胞核中合成，形成發夾結構，莖區成對的反義和正義鏈與未配對的成環核苷酸連接在一起，通過與miRNA的加工相同的RNA干擾（RNAi）機制，shRNA被加工成siRNA。RNAi是有效沉默或抑制目標基因表達的過程，該過程通過雙鏈RNA（dsRNA）使得目標基因相應的mRNA選擇性失活來實現的。使用細菌或病毒載體，shRNA能夠被導入靶細胞的細胞核內，在某些情況下，載體可以穩定地整合到基因組中。目前，shRNA表達載體可分為病毒載體和非病毒載體兩類，病毒作載體雖然轉染效率高，但臨床應用易引起免疫原性，其臨床安全性一直倍受關注；非病毒載體相對安全，但轉染效率低。因此，亟需一種能夠克服病毒載體和非病毒載體缺點的shRNA表達載體材料。

關于靶向線粒體納米材料負載的物質基本是藥物或者探針，利用靶向線粒體納米材料負載探針常常應用在線粒體成像或蛋白質標記中，線粒體成像能夠實時監控細胞內線粒體的形態和數量變化，進而實現疾病的早期預判，蛋白質標記；利用靶向線粒體納米材料負載藥物能夠有助于將藥物遞送到線粒體中，有效地治療與線粒體有關的疾病；但是，關于負載shRNA表達載體的靶向線粒體納米材料的研究鮮有，主要是因為普通的shRNA表達載體難以導入線粒體且普通的shRNA表達載體導入線粒體的效率低。

發明內容

本發明提供靶向線粒體負載shRNA的納米材料及其制備方法，提高了shRNA表達載體導入線粒體的效率，將靶向線粒體負載shRNA的納米材料應用在細胞實驗中可以將負載的shRNA表達載體高效運送至線粒體內，從而沉默線粒體內特定靶基因的表達，便于研究該線粒體基因的作用。

本發明采用的技術方案如下：

第一方面，本發明提供了靶向線粒體負載shRNA的納米材料，所述納米材料為線粒體靶向肽和shRNA表達載體通過電荷吸附成為核心的復合物，復合物表面共價連接pH響應聚合物，在高速旋渦的作用下形成的納米顆粒。