[發明專利]靶向線粒體負載shRNA的納米材料及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 202010570215.2
• 申請日: 2020-06-21
• 公開（公告）號: CN111635911A
• 公開（公告）日: 2020-09-08
• 發明（設計）人: 趙綺毅;劉嘉煜;梁蕙欣
• 申請（專利權）人: 中山大學附屬第三醫院
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/87;B82Y5/00;B82Y40/00
• 代理公司: 福州科揚專利事務所 35001
• 代理人: 吳嘉濱

1.靶向線粒體負載shRNA的納米材料，其特征在于：所述納米材料為線粒體靶向肽和shRNA表達載體通過電荷吸附成為核心的復合物，復合物表面共價連接pH響應聚合物，在高速旋渦的作用下形成的納米顆粒。

2.如權利要求1所述的靶向線粒體負載shRNA的納米材料的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）合成pH響應聚合物Meo-PEG-b-PDPA和線粒體靶向肽；

（2）使用pLKO.1-puro載體質粒構建shRNA表達載體；

（3）將經過步驟（1）合成的Meo-PEG-b-PDPA溶解在二甲基甲酰胺中，形成均相溶液；

（4）將經步驟（2）合成的shRNA表達載體溶于去離子水中形成shRNA表達載體水溶液；同時將經過步驟（1）合成的線粒體靶向肽溶于二甲基亞砜中形成線粒體靶向肽二甲亞砜溶液；

（5）將經過步驟（4）制得的shRNA表達載體水溶液和線粒體靶向肽二甲亞砜溶液混合后，再與Meo-PEG-b-PDPA均相溶液混合；混合液經強力攪拌均勻后，在高速渦旋的作用下形成納米顆粒；將混合液滴加到去離子水中，最終形成負載shRNA的靶向線粒體納米顆粒；

（6）將經過步驟（5）形成的負載shRNA的靶向線粒體納米顆粒轉移至超濾裝置中，離心去除有機溶劑和游離化合物，然后用超純水洗滌，最后用超純水定容至1mL。

3.如權利要求2所述的靶向線粒體負載shRNA的納米材料的制備方法，其特征在于：所述步驟（2）中構建shRNA表達載體包括針對靶基因的shRNA-1、shRNA-2以及作為對照的sh-Ctrl；合成shRNA寡核苷酸序列，將其克隆到pLKO.1-puro載體質粒中，并進行測序驗證。

4.如權利要求2所述的靶向線粒體負載shRNA的納米材料的制備方法，其特征在于：所述步驟（3）中均相溶液的濃度為10mg/mL。

5.如權利要求2所述的靶向線粒體負載shRNA的納米材料的制備方法，其特征在于：所述步驟（4）中shRNA表達載體水溶液的濃度為1mg/mL；所述線粒體靶向肽二甲亞砜溶液的濃度為5mg/mL。

6.如權利要求1所述的靶向線粒體負載shRNA的納米材料應用在細胞實驗中進而實現線粒體內特定靶基因的表達沉默。