[發明專利]一種新型的鈉鉀ATP酶的檢測方法

在審

• 申請號: 202010570179.X
• 申請日: 2020-06-21
• 公開（公告）號: CN111678971A
• 公開（公告）日: 2020-09-18
• 發明（設計）人: 殷放宙;殷武;戴輝;李偉東;李林
• 申請（專利權）人: 南京中醫藥大學
• 主分類號: G01N27/62
• 分類號: G01N27/62
• 代理公司: 江蘇法德東恒律師事務所 32305
• 代理人: 胡玲

目前用于評估鈉鉀ATP酶活性較為常用的方法為放射性示蹤法或比色法。但這兩種方法均存在缺陷，前者需要使用放射性同位素，對實驗環境要求高；后者則在檢測準確度、靈敏度與重復性上相對較弱。本發明引入一種新方法進行細胞鈉鉀ATP酶活性的檢測，通過電感耦合等離子體質譜法(ICP?MS)精確定量轉運進細胞的銣離子，由此測得細胞內銣離子的轉運率，進而評估鈉鉀ATP酶的活性。此方法具有無放射性、可靠、準確等優點。

技術領域

本發明涉及檢測ATP酶活性領域，具體涉及通過電感耦合等離子體質譜(ICP-MS)的方法檢測細胞鈉鉀ATP酶對銣離子(Rb⁺)跨膜轉運量的方法來評估鈉鉀ATP酶的活性。

背景技術

鈉鉀ATP酶(Na，K-ATPase)，又名Na⁺-K⁺泵，于1957年由J.C.Skou所發現，由α、β兩亞基組成。α亞基為分子量約為120kD的跨膜蛋白，既有Na+、K+結合位點，又具ATP酶活性。β亞基為小亞基，是分子量約為50kD的糖蛋白。鈉鉀ATP酶存在于所有真核細胞中，是一種金屬離子轉運蛋白，每消耗一個ATP分子，逆電化學梯度泵出3個鈉離子和泵入2個鉀離子，保持膜內高鉀，膜外高鈉的不均勻離子分布，由此維持細胞膜靜息電位的穩定、離子、滲透壓與pH平衡，發揮著非常重要的細胞功能。經科學研究發現鈉鉀ATP酶在人體的正常代謝中具有非常重要的作用，與一些疾病的發生也有著密切的關系，如腦水腫、白內障、囊纖維化、癲癇、偏頭痛、高血壓等。

目前，用于評估鈉鉀ATP酶活性較為精確的方法主要是檢測該轉運蛋白對放射性86Rb的轉運效率，通常由放射性示蹤法來確定，采用伽馬計數儀檢測86Rb，但這種方法需要使用放射性同位素，對實驗操作環境要求高，限制鈉鉀ATP酶的快速檢測。也有采用比色法對鈉鉀ATP酶活性進行檢測，其原理在于在含Na⁺，K⁺、Mg²⁺的緩沖液中，加入ATP和酶，在37℃溫育10min后，ATP被酶分解成ADP和無機磷(Pi)，在酸性環境中，定磷試劑中的鉬酸銨以鉬酸形式與樣品中的磷酸反應生成磷鉬酸，當有還原劑存在時磷鉬酸立即轉變藍色的還原產物鉬藍，鉬藍在650-660nm波長處有最大的吸收。以每毫克蛋白每小時新產生的Pi量為酶的活性單位，所得結果為總ATP酶活性。緩沖液中加Na⁺，K⁺-ATP酶的特異性抑制劑哇巴因，所得結果為Mg²⁺-ATP活性，兩者之差即為Na⁺，K⁺-ATP酶活性。比色法的對實驗環境要求不高，但靈敏度較低。

發明內容

發明目的：提供一種基于電感耦合等離子體質譜(Inductively coupled plasmamass spectrometry，ICP-MS)檢測方法，用于測定真核細胞膜鈉鉀ATP酶活性的方法。

技術方案：針對背景技術中的情況，本發明選用⁸⁶Rb的無放射性替代物氯化銣(RbCl)，采用電感耦合等離子體質譜法(Inductively coupled plasma massspectrometry，ICP-MS)測定Rb⁺跨膜轉運量來評價鈉鉀ATP酶的活性。Rb⁺與K⁺為同系物，以同樣方式經Na⁺，K⁺-ATP酶攝入細胞內，且Rb⁺是自然狀態下細胞內不存在的離子，環境干擾小，易于檢測。因此，通過儀器檢測轉運進細胞的Rb⁺，可以估鈉鉀ATP酶的活性。