[發(fā)明專利]一種新型的鈉鉀ATP酶的檢測方法

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• 申請日: 2020-06-21
• 公開（公告）號: CN111678971A
• 公開（公告）日: 2020-09-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 殷放宙;殷武;戴輝;李偉東;李林
• 申請（專利權(quán)）人: 南京中醫(yī)藥大學(xué)
• 主分類號: G01N27/62
• 分類號: G01N27/62
• 代理公司: 江蘇法德東恒律師事務(wù)所 32305
• 代理人: 胡玲

1.一種新型的鈉鉀ATP酶的檢測方法，其包括以下步驟：

(1)將細胞按適宜的方法培養(yǎng)、加RbCl溶液、裂解、測蛋白、消化、趕酸、制備供試品溶液。

(2)以銣Rb單元素標準溶液為標準品，以釔Y單元素標準溶液為內(nèi)標，采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法檢測Rb⁺的攝入量。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型的鈉鉀ATP酶的檢測方法，其特征在于，所述的步驟1細胞培養(yǎng)及處理方法如下：氯化銣用含鈣、鎂Hank's溶液溶解稀釋；將正常培養(yǎng)的細胞接種到孔板中，并至細胞覆蓋約70－80％的板底時，對照組直接加入含RbCl的Hank's溶液，給藥組加入藥物處理細胞后再加入含RbCl的Hank's溶液；在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)后，吸凈含RbCl的Hank's溶液，用無RbCl的Hank's溶液洗滌細胞，裂解細胞，二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白質(zhì)濃度；另加入濃硝酸和內(nèi)標Y在室溫下消化細胞，消化完成后再加入H₂O₂趕酸直至棕色氣體消失，最后用超純水將溶液定容到適宜的體積。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型的鈉鉀ATP酶的檢測方法，其特征在于，步驟1：將正常培養(yǎng)的細胞調(diào)整為4×10⁵－5×10⁵個/mL，接種到孔板中；在細胞覆蓋約70－80％的板底時，加入藥物處理細胞24h后再加入含RbCl的Hank's溶液1mL；在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h后，將含RbCl的Hank's溶液溶液吸凈，用無RbCl的Hank's溶液洗滌細胞3次；隨后，用裂解液裂解細胞，用BCA測定蛋白質(zhì)濃度，另加入濃硝酸1mL和使終濃度達到20μg/L的內(nèi)標Y在室溫下消化細胞2h；消化完成后，加入250μLH₂O₂在100℃下趕酸2h，直到棕色氣體消失，最后用超純水將溶液定容至40mL。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型的鈉鉀ATP酶的檢測方法，其特征在于，步驟2：以銣(Rb)單元素標準溶液。其制備方法為用2.5％HNO₃水溶液(v/v)溶解稀釋至12.5－1000μg/L濃度作為標準品溶液；以釔(Y)單元素標準溶液用2.5％HNO₃水溶液(v/v)溶解稀釋至8mg/L濃度作為內(nèi)標母液。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型的鈉鉀ATP酶的檢測方法，其特征在于，所述的步驟2電感耦合等離子體質(zhì)譜法的參數(shù)為：射頻功率、冷卻氣流量、輔助氣流量、霧化器流量、采樣深度、蠕動泵轉(zhuǎn)速、掃描方式、掃描次數(shù)、重復(fù)采樣次數(shù)；RF射頻功率1100W，冷卻氣流量15L/min，輔助氣流量1.2L/min，霧化器流量0.99L/min，采樣深度7.0mm，蠕動泵轉(zhuǎn)速24r/min，掃描方式單點跳峰，掃描次數(shù)20次，重復(fù)采樣3次。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型的鈉鉀ATP酶的檢測方法，其特征在于，所述的步驟2的特征在于：采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法進行樣品檢測，其方法是根據(jù)標準曲線計算Rb⁺含量，并除以蛋白質(zhì)濃度，得到每克蛋白質(zhì)的Rb⁺轉(zhuǎn)運濃度作為最終結(jié)果。