[發明專利]一種凍存人PBMC復蘇后體外誘導NK細胞的培養方法

有效

• 申請號: 202010568577.8
• 申請日: 2020-06-19
• 公開（公告）號: CN111718899B
• 公開（公告）日: 2021-11-23
• 發明（設計）人: 孔偉圣;藍欣;何娟娟;陳智妍
• 申請（專利權）人: 珠海貝索細胞科學技術有限公司
• 主分類號: C12N5/078
• 分類號: C12N5/078;C12N5/0783
• 代理公司: 廣東朗乾律師事務所 44291
• 代理人: 楊煥軍

本發明涉及一種凍存人PBMC復蘇后體外誘導NK細胞的培養方法。包括細胞復蘇、NK細胞的誘導、NK細胞擴增三個步驟；其中，在NK細胞的誘導階段，使用CD 16、胸腺肽用PBS液稀釋后進行培養瓶包被；取無血清培養液加入IL?2、IL?12、IL?15配制成誘導培養基；取無血清培養液加入IL?2、IL?7配制成活化培養基；取無血清培養液加入IL?2配制成擴增培養基，day3采用半換液進行補液進行活化培養。利用本發明培養方法進行凍存人PBMC復蘇后體外誘導NK細胞簡單高效，既降低了細胞培養成本，又提高了細胞培養的安全性，可以有效克服凍存的PBMC誘導NK細胞困難，擴增數量的不足，達到細胞治療的目的，使其抗腫瘤、抗病毒及抗感染能力增強。

技術領域

本發明屬于免疫細胞治療技術領域，涉及一種凍存人PBMC(外周血單個核細胞)復蘇后體外誘導NK細胞的培養方法。

技術背景

自然殺傷細胞(natural killer cells，NK細胞)，是一群大顆粒淋巴細胞，是機體對抗病原體和腫瘤細胞的第一道防線。NK細胞主要分布于外周血中，占外周淋巴細胞的5～10％，淋巴結和骨髓中也存在有NK活性，但與外周血相比較水平較低。

隨著對NK細胞的深入研究，NK細胞在人體的應用也越來越廣泛，目前在抗腫瘤、對抗衰老、亞健康治療、疾病預防等方面都有較好的作用。首先，NK細胞具有細胞毒性功能，它能直接殺傷腫瘤細胞。其次，NK細胞可以與衰老或者病變細胞表面的受體結合，釋放出穿孔素、顆粒酶和一些細胞因子，誘導細胞凋亡信號的產生，促使衰老或者病變的細胞走向凋亡，恢復機體內微環境的平衡，減緩炎癥狀態。同時NK細胞還能刺激和恢復機體新生細胞的產生，改善細胞質量，提高細胞活性，以此來防止和延緩細胞的病變，并恢復細胞、器官和免疫系統的功能，從而來達到疾病預防、康復以及對抗衰老的目的。

腫瘤患者在采用NK細胞治療時，一般在手術切除后治療或者與作為放療化療的輔助治療。然而，患者在接受手術切除或者放化療治療之后，機體的免疫功能低下，并不利于抽血進行NK細胞體外培養，因此，對于有需要進行NK細胞治療的患者，我們需要在手術或者放化療前進行抽血并保存。且隨著細胞儲備概念的普及，較多的人選擇在自己健康狀態良好的時候，凍存部分PBMC，可用于今后亞健康及疾病的治療。之所以選擇凍存PBMC，首先是因為，NK細胞從血液中很難分離出來。其次，NK細胞在外周血中所占的比例非常小，如果我們直接對抽取的血液進行保存成本過高。再次，PBMC較易從血液中被分離出來，且被凍存過的PBMC仍具有高效誘導NK細胞的能力。

對于細胞的保存，細胞凍存是主要方法之一，也是目前最常見的方法。利用凍存技術可以將細胞置于-196℃液氮中進行低溫保存，讓細胞暫時脫離生長狀態但將其細胞的特性保存了起來，這樣在我們需要的時候再將細胞復蘇用于實驗。目前細胞凍存多采用程序降溫的方法，慢凍的基本原則，這樣可以最大限度的保存細胞活率。復蘇細胞則采用快速融化的方法，這樣可以保證細胞外結晶在很短的時間內即融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細胞內形成胞內再結晶對細胞造成損傷。這樣凍存復蘇過后的細胞，會因凍存液的配制和凍存時間的影響，雖在形態上無明顯差異，但在數量上會有較大的損失，誘導成NK細胞較為困難。另外，目前外周血NK細胞的培養方法主要有因子誘導法、滋養層細胞共培養法、流式分選細胞再培養法三種；但是對于凍存復蘇后的PBMC，前述三種方法誘導出來的NK細胞活率較差、誘導方法不穩定且爭議較大。

發明內容

本發明的目的在于提供一種凍存人PBMC復蘇后體外誘導NK細胞的培養方法；促進凍存復蘇后的PBMC誘導NK細胞的效率、數量的提升和安全性。

本發明的目的通過如下技術方案實現：

一種凍存人PBMC復蘇后體外誘導NK細胞的培養方法，包括細胞復蘇、NK細胞的誘導、NK細胞擴增三個步驟；

所述NK細胞誘導步驟具體包括：

Day0，使用CD 16、胸腺肽用PBS液稀釋，進行培養瓶包被，混勻后室溫靜置60min，加入PBS液洗滌一次；