[發明專利]一種凍存人PBMC復蘇后體外誘導NK細胞的培養方法

有效

• 申請號: 202010568577.8
• 申請日: 2020-06-19
• 公開（公告）號: CN111718899B
• 公開（公告）日: 2021-11-23
• 發明（設計）人: 孔偉圣;藍欣;何娟娟;陳智妍
• 申請（專利權）人: 珠海貝索細胞科學技術有限公司
• 主分類號: C12N5/078
• 分類號: C12N5/078;C12N5/0783
• 代理公司: 廣東朗乾律師事務所 44291
• 代理人: 楊煥軍

1.一種凍存人PBMC復蘇后體外誘導NK細胞的培養方法，包括細胞復蘇、NK細胞的誘導、NK細胞擴增三個步驟；其特征在于，

所述細胞復蘇步驟具體包括：

(1)在2分鐘內，將待復蘇細胞從液氮中取出，并立刻轉移到37℃水浴鍋內快速溶解；

(2)將溶解的細胞混懸液轉移到已預熱至37℃的5倍體積無血清培養液中，常溫下500xg離心，棄上清；

(3)加入含10%自體血漿的無血清培養液，按1.0×10⁶個/ml的密度，重懸細胞；

(4)重懸細胞后，將細胞放于37℃、5% CO₂的細胞培養箱中孵育60 min，離心收集細胞；

所述NK細胞誘導步驟具體包括：

第0天，將 CD16、胸腺肽用PBS液稀釋，進行培養瓶包被，混勻后室溫靜置60min，加入PBS液洗滌一次；

第0天，取無血清培養液加入IL-2、IL-12和IL-15 配制成誘導培養基，使用誘導培養基將孵育后離心的PBMC按密度2.5~3.0×10⁶個/ml接種到包被好的瓶中，添加10%滅活的自體血漿，靜置于37℃、 5%CO₂培養箱培養；

第3天，取無血清培養液加入IL-2和IL-7配制成活化培養基；采用半換液進行補液，將細胞離心后，半換液重懸細胞接種回原瓶，并補加入等量的活化培養基；

第5天和第7天補加活化培養基，使細胞密度維持1.5~2×10⁶個/ml，第7天轉到細胞培養袋擴大培養。

2.根據權利要求1所述培養方法，其特征在于，所述CD16有效濃度范圍為500 μg/cm²~1500 μg/cm²；所述胸腺肽有效濃度范圍為150 μg/cm²~500 μg/cm²。

3.根據權利要求2所述培養方法，其特征在于，所述CD16有效濃度為500 μg/cm²；所述胸腺肽有效濃度為150 μg/cm²。

4.根據權利要求1所述培養方法，其特征在于，所述誘導培養基中IL-2、IL-12和IL-15的有效濃度范圍分別為100IU/ml~1000IU/ml、10IU/m~200IU/ml和10IU/ml~50IU/ml。

5.根據權利要求4所述培養方法，其特征在于，所述誘導培養基中IL-2、IL-12和IL-15的有效濃度分別為1000 IU/ml、50 IU/ml和20IU/ml。

6.根據權利要求1所述培養方法，其特征在于，所述活化培養基中IL-2和IL-7的有效濃度范圍分別為100IU/ml~1000IU/ml和1IU/ml~100IU/ml。

7.根據權利要求6所述培養方法，其特征在于，所述活化培養基中IL-2和IL-7的有效濃度分別為1000 IU/ml和100 IU/ml。

8.根據權利要求1所述培養方法，其特征在于，所述NK細胞擴增步驟具體包括：

取無血清培養液，加入IL-2配制成擴增培養基，每兩天補加擴增培養基，細胞密度維持1~1.5×10⁶個/ml，靜置于37℃、 5%CO₂培養箱培養；

第14天收獲細胞，并洗滌計數和檢測。

9.根據權利要求8所述培養方法，其特征在于，所述擴增培養基中IL-2的有效濃度范圍分別為100IU/ml~1000IU/ml。

10.根據權利要求9所述培養方法，其特征在于，所述擴增培養基中IL-2的有效濃度為500IU/ml。

11.根據權利要求1-10任意一項所述培養方法，其特征在于，

所述細胞復蘇步驟具體包括：

(1)將待復蘇細胞從液氮中取出，立刻轉移到37℃水浴鍋內，快速溶解，整個過程不能超過2分鐘；

(2)將溶解的細胞混懸液轉移到已預熱至37℃的5倍體積ALyS505NK-EX培養基中，常溫下500xg離心，棄上清；

(3)加入含10%自體血漿的ALyS505NK-EX培養基，按1.0×10⁶個/ml的密度，重懸細胞；

(4)重懸細胞后，將細胞放于37℃、5% CO₂的細胞培養箱中孵育60 min，離心收集細胞；

所述NK細胞誘導步驟具體包括：

第0天，將CD16、胸腺肽用PBS稀釋，進行培養瓶包被，混勻后室溫靜置60min，加入PBS洗滌一次；

第0天，取ALyS505NK-EX加入IL-2、IL-12和IL-15配制成誘導培養基，使用誘導培養基將孵育后離心的PBMC按密度2.5~3.0×10⁶個/ml接種到包被好的瓶中，添加10%滅活的自體血漿，靜置于37℃、 5%CO₂培養箱培養；

第3天，取ALyS505NK-EX加入IL-2和IL-7配制成活化培養基；采用半換液進行補液，將細胞離心后，半換液重懸細胞接種回原瓶，并補加入等量的活化培養基；

第5天和第7天補加活化培養基，使細胞密度維持1.5~2×10⁶個/ml，第7天轉到細胞培養袋擴大培養；

所述NK細胞擴增步驟具體包括：

取ALyS505NK-EX，加入IL-2配制成擴增培養基，每兩天補加擴增培養基，細胞密度維持1~1.5×10⁶個/ml，靜置于37℃、 5%CO₂培養箱培養；

第14天收獲細胞并洗滌計數，通過流式細胞儀檢測CD3^-CD56⁺細胞所占比例，同時進行細胞活性檢測、殺瘤活性、內毒素、真菌細菌和支原體檢測。