[發明專利]一種EGFR基因19號外顯子E746-A750突變基因的檢測方法

在審

• 申請號: 202010567618.1
• 申請日: 2020-06-19
• 公開（公告）號: CN111676289A
• 公開（公告）日: 2020-09-18
• 發明（設計）人: 張慧;劉珍妮;聶志超;張茹松
• 申請（專利權）人: 安徽微分基因科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6869
• 代理公司: 安徽申策知識產權代理事務所(普通合伙) 34178
• 代理人: 程艷梅

1.一種EGFR基因19號外顯子E746-A750突變基因的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1、用E746-A750位點的PCR擴增引物對不同突變頻率的E746-A750標準品(WT-E746-A750、10％-E746-A750、1％-E746-A750、0.1％-E746-A750)進行Taq酶PCR擴增；

S2、對不同突變頻率的E746-A750標準品(WT-E746-A750、10％-E746-A750、1％-E746-A750、0.1％-E746-A750)PCR擴增產物進行二代測序文庫構建；

S3、對合成的上下游sgRNA探針(E746-A750-prob-PF、E746-A750-prob-PR)進行變性退火；

S4、對退火后的sgRNA探針(E746-A750-prob-PF-PR)進行轉錄及轉錄后磁珠純化；

S5、對構建完成的不同突變頻率的E746-A750標準品(WT-E746-A750、10％-E746-A750、1％-E746-A750、0.1％-E746-A750)DNA文庫進行Cas9酶的消化系統消化、Agilent 4200檢測不同突變頻率的E746-A750標準品(WT-E746-A750、10％-E746-A750、1％-E746-A750、0.1％-E746-A750)DNA文庫的消化結果；

S6、用二代測序通用引物(PCR Primer Mix2)對消化完成的不同突變頻率的E746-A750標準品(WT-E746-A750、10％-E746-A750、1％-E746-A750、0.1％-E746-A750)DNA文庫進行PCR富集，對PCR富集的已消化不同突變頻率的E746-A750標準品(WT-E746-A750、10％-E746-A750、1％-E746-A750、0.1％-E746-A750)DNA文庫進行DNA磁珠純化；

S7、對純化后PCR富集的已消化不同突變頻率的E746-A750標準品(WT-E746-A750、10％-E746-A750、1％-E746-A750、0.1％-E746-A750)DNA文庫進行Miseq PE300測序；

S8、對Miseq PE300測序結果進行數據分析，給出結論。

2.根據權利要求1所述的一種EGFR基因19號外顯子E746-A750突變基因的檢測方法，其特征在于：所述方法中的10％突變型標準品(10％-E746-A750)、1％突變型標準品(1％-E746-A750)、0.1％突變型標準品(0.1％-E746-A750)均由野生型標準品(WT-E746-A750)及50％突變型標準品(50％-E746-A750)按照Qubit熒光定量所測得的質量比混制而成。

3.根據權利要求1所述的一種EGFR基因19號外顯子E746-A750突變基因的檢測方法，其特征在于：所述方法中的E746-A750位點的長度為418bp。

4.根據權利要求1所述的一種EGFR基因19號外顯子E746-A750突變基因的檢測方法，其特征在于：所述方法中的E746-A750位點的PCR擴增引物序列為：E746-A750-PF取5′-AGCAATATCAGCCTTAGGTGCG-3′；E746-A750-PR取5′-GAGGCCAGTGCTGTCTCTAAGG-3′。